形態(tài)學(xué)檢查方法是細(xì)菌檢驗(yàn)中極為重要的鑒定手段之一，它不僅有助于細(xì)菌的初步識(shí)別，同時(shí)也是決定進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定的重要步驟。如痰中的抗酸桿菌、腦脊液中腦膜炎球菌、泌尿生殖道分泌物中的淋球菌等。通過形態(tài)學(xué)檢查得到初步的診斷。由于細(xì)菌體積小，無色透明， 因此利用光學(xué)顯微鏡直接檢查只能觀察到細(xì)菌的動(dòng)力，對(duì)形態(tài)、大小、排列方式、染色特性及特殊結(jié)構(gòu)的判定，還須借助于染色標(biāo)本的觀察。要研究其細(xì)菌的超微結(jié)構(gòu)，還需用電子顯微鏡。
一、不染色標(biāo)本檢查法
不染色標(biāo)本的檢查用于觀察活菌狀態(tài)，常用以檢查細(xì)菌的動(dòng)力或運(yùn)動(dòng)狀況。
1．濕片法：用接種環(huán)取細(xì)菌培養(yǎng)液兩環(huán)， 置于載玻片中央，輕輕覆以蓋玻片。菌液要適量，不可外溢，不可有氣泡。高倍鏡下觀察。
2．懸滴法：加一小滴菌液在蓋玻片中央，在另一凹玻片凹窩的周圍涂少量凡士林，將凹面向下，對(duì)準(zhǔn)蓋玻片中央，蓋在凹玻片上，迅速翻轉(zhuǎn)玻片，用小鑷子輕壓，使蓋玻片與m.f1411.cn凹玻片粘緊，密封凹窩邊緣。高倍鏡下觀察。
3．毛細(xì)管法：本法適用于觀察厭氧菌動(dòng)力。先將待檢菌接種在適宜的液體培養(yǎng)基中，經(jīng)厭氧過夜培養(yǎng)后，以毛細(xì)管（長(zhǎng)60～70nm ，管徑0．5 ～1．0nm ) 接觸培養(yǎng)物，使菌液進(jìn)入毛細(xì)管中，用火焰封閉毛細(xì)管兩端，將毛細(xì)管固定在載玻片上，鏡檢。
二、染色標(biāo)本檢查法
（一) 基本方法
細(xì)菌胞漿無色透明，不易識(shí)別。常用適宜的染料使細(xì)菌著色后，以觀察其形態(tài)和特殊構(gòu)造，且可按染色反應(yīng)進(jìn)行分類。
1．原理
（1) 物理吸附作用：由于毛細(xì)管現(xiàn)象和滲透作用， 使染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被溶解吸收。此外，細(xì)菌等電點(diǎn)較低，pH值2 ～5，在一般情況下細(xì)菌帶負(fù)電荷，易和帶正電荷的堿性染料相結(jié)合。
（2) 化學(xué)反應(yīng)：菌體內(nèi)某些化合物和染料相結(jié)合，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)使細(xì)菌著色，而且不易被脫色劑所脫色。
（3) 其他因素：細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否以及培養(yǎng)基成分，染色液中電解質(zhì)含量、pH值、菌齡等都是影響細(xì)菌著色的因素。
2．方法
（1) 涂片：臨床標(biāo)本大多可直接涂抹在潔凈的載玻片上。若是細(xì)菌的液體培養(yǎng)物，可直接加一小滴在載玻片，稍加涂布。若是從固體培養(yǎng)基上取細(xì)菌菌落，則應(yīng)先用接種環(huán)取一環(huán)生理鹽水置于玻片上，然后從培養(yǎng)基上取少許菌在鹽水中輕輕磨勻，使呈輕微乳白渾濁，再涂布擴(kuò)大至直徑20 mm 大小的圓形，待自然干燥，也可加微熱使其干燥。
（2) 固定：涂片干燥后，在火焰上迅速通過3 次加以固定。固定過程可殺死細(xì)菌，凝固細(xì)胞質(zhì)和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增加細(xì)菌細(xì)胞對(duì)染液的通透性，還可使細(xì)菌涂膜牢固，不被在染色過程中的流水沖洗脫落。
（3) 染色：一般用低濃度染色液（1％以下)，滴加染液覆蓋涂膜。分單染法和復(fù)染法。為促使染料與菌體結(jié)合，有的染色法可在染液中加入酚、明礬，有的在染色過程中加碘液，可起到媒染的作用，也有用加熱法促進(jìn)著色的。
（4) 脫色：一般應(yīng)用乙醇、丙酮或酸類作為脫色劑。適當(dāng)掌握脫色時(shí)間以獲良好的效果。脫色劑可以顯示出細(xì)菌與染料結(jié)合的牢固程度，具有鑒別染色的作用。
（5) 復(fù)染：復(fù)染液應(yīng)與初染液的顏色不同，以形成鮮明對(duì)比。復(fù)染可使已脫色的細(xì)菌重新著色。
（二) 常用染色法
1．單染法
即用一種染液染色的方法。
（1) 染液①呂氏亞甲藍(lán)液：以亞甲藍(lán)乙醇飽和溶液（乙醇100 ml 含亞甲藍(lán)2～5g)30 ml 加蒸餾水100 ml 及10％氫氧化鉀0．1 ml 混合即成。②稀釋石炭酸復(fù)紅液：以堿性復(fù)
紅乙醇飽和液（乙醇100 ml 含堿性復(fù)紅3～7g)10 ml 與5％石炭酸液90 ml 混合， 配成石炭酸復(fù)紅染液。再將此染液以蒸餾水作10 倍稀釋即成。
（2) 方法：在已固定的細(xì)菌涂片上滴加呂氏美藍(lán)液或稀釋石炭酸復(fù)紅，染1 分鐘，水洗，干后鏡檢。
（3) 結(jié)果：以呂氏亞甲藍(lán)染色， 菌體呈藍(lán)色。以稀釋石炭酸復(fù)紅染色，菌體呈紅色。
2．革蘭染色法
為最常用的細(xì)菌復(fù)染法。
（
1) 染液：第一液：取結(jié)晶紫乙醇飽和液（乙醇100 ml 含結(jié)晶紫7 ～14g)20 ml 與醫(yī)學(xué)全在,線1 ％草酸銨水溶液80 ml 混合過濾即成。第二液：碘1g ，碘化鉀2g ，加少量蒸餾水，充分振搖，溶解后加水至300 ml 。第三液：95 ％ 乙醇或用乙醇、丙酮（7 ∶3) 混合液。第四液：稀釋石炭酸復(fù)紅液（同單染法) 或沙黃溶液（2．5 ％沙黃乙醇液10 ml 加水90 ml)。
（2) 方法：將第一液滴加在已固定的細(xì)菌涂片上，染1 分鐘，水洗。再以第二液媒染1 分鐘，水洗。繼以第三液脫色。輕搖玻片，到無紫色脫落為止，水洗。最后以第四液復(fù)染0．5 分鐘，水洗，干后鏡檢。
（3) 結(jié)果：革蘭陽性菌呈紫色，革蘭陰性菌呈紅色。
3．抗酸染色法
（1) 染液：①石炭酸復(fù)紅染液：同單染法，但不需用蒸餾水稀釋。②脫色劑：為鹽酸乙醇。③復(fù)染液（呂氏亞甲藍(lán)液) 同單染法。
（2) 方法：在涂片上滴加石炭酸復(fù)紅染液，玻片遠(yuǎn)離火焰使微微加熱而有蒸汽，染液因蒸發(fā)而減少，需隨時(shí)補(bǔ)加染液，防止干涸。如此維持5 分鐘。待冷后，水洗。滴加脫色劑，輕搖玻片，到無紅色流出為止，脫色時(shí)間約1 分鐘。水洗。再滴加復(fù)染液復(fù)染0．5 分鐘，水洗。干后鏡檢。
（3) 結(jié)果：抗酸菌呈紅色，背景及其他細(xì)菌呈藍(lán)色。
4．金胺染色法
（1) 染液：① 金胺“O ” 染液： 金胺“O ”0．1g 溶于95 ％ 乙醇10 ml，另取石酸3 ml 加水87 ml 中。將上述兩液混勻（若有渾濁，不必過濾)，裝人褐色瓶中，保存在室溫中。②0．5 ％鹽酸乙醇。③0．5 ％高錳酸鉀液。
（2) 方法：在細(xì)菌涂片上加金胺“O” 染液，染15 分鐘，水洗后用0．5 ％鹽配乙醇脫色2 分鐘，水洗，再加0．5 ％高錳酸鉀液作用3 分鐘，水洗， 待干，用熒光顯微鏡觀察。
（3) 結(jié)果：抗酸菌呈亮黃色熒光。
5．阿爾培（Albert) 異染顆粒染色法
（1) 染液：第一液： 甲苯胺藍(lán)0．15g ， 孔雀綠0．2g 溶于95 ％ 乙醇2 ml 中， 加水100 ml 及冰乙酸1 ml ，靜置24 小時(shí)，濾紙過濾。第二液：碘化鉀3g 溶于蒸餾水10 ml ，加
碘2g ，溶解后再加水至300 ml 。
（2) 方法：在涂片上加第一液染色3 ～5 分鐘，水洗后第二液染色1 分鐘，水洗，待干后鏡檢。
（3) 結(jié)果：異染顆粒呈藍(lán)黑色，菌體呈綠色。
6．奈瑟（Neisser) 異染顆粒染色法
（1) 染液：第一液：亞甲藍(lán)100 mg 溶于無水乙醇2 ml 中，加入5 ％冰乙酸98 ml ，充分混合，過濾。第二液：俾斯麥褐1g 溶于無水乙醇10 ml 后，加水至100 ml ，充分混合。過濾。
（2) 方法：在細(xì)菌涂片上滴加第一液，染色30 秒至1 分鐘，水洗后，再以第二液染色30 秒至1 分鐘，水洗，干后鏡檢。
（3) 結(jié)果：白喉桿菌菌體染成淡黃褐色，異染顆粒呈深藍(lán)色。
7．黑氏（Hiss) 莢膜染色法
（1) 染液：①結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫乙醇飽和液5ml 加水95ml 。②20 ％硫酸銅水溶液。
（2) 方法：細(xì)菌涂片自然干燥后用乙醇固定。滴加結(jié)晶紫染液，加溫染1 分鐘，不
用水洗，用20 ％硫酸銅溶液中沖洗后，以吸水紙吸干鏡檢。
（3) 結(jié)果：菌體呈紫色，莢膜為淡紫色或無色。
8．奧爾特（Olt) 莢膜染色法
（1) 染液：30 ％沙黃水溶液（乳缽研磨溶化)。
（2) 方法：在細(xì)菌涂片上滴加染液，用火焰加溫染色3 分鐘，冷后水洗， 待干后鏡檢。
（3) 結(jié)果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色。此法主要用于炭疽桿菌的莢膜染色。
9．芽胞染色法
（1) 稀釋石炭酸復(fù)紅液（同單染法)，95 ％乙醇，堿性亞甲藍(lán)液（同單染法)。
（2) 方法：滴加石炭酸復(fù)紅液， 加溫染5 分鐘，水洗后用乙醇脫色2 分鐘，水洗，滴加亞甲藍(lán)液染1 分鐘，水洗，待干鏡檢。
（3) 結(jié)果：菌體呈藍(lán)色，芽胞呈紅色。
10．魏—張鞭毛染色法
（1) 染液：飽和鉀明礬液5 ml ，5 ％石炭酸液5 ml ，20 ％鞣酸液2 ml ，三者相互混合。臨用時(shí)加堿性復(fù)紅乙醇飽和液1 ml ，混合后靜止過夜，次日過濾后使用。此染液以
3 天內(nèi)使用效果最佳。
（2) 方法：①先將細(xì)菌在肉湯培養(yǎng)基中傳代6 ～7 次。② 取出斜面培養(yǎng)基管內(nèi)的凝結(jié)水，換以無菌生理鹽水2 ml 。③取細(xì)菌的肉湯培養(yǎng)物一環(huán)，接種在斜面瓊脂與護(hù)士招聘網(wǎng)鹽水交界處，再自該部向上劃一直線。④ 在35 ℃ 培育7 ～16 小時(shí)， 若為變形桿菌， 則放在22 ℃～25 ℃下培育16 小時(shí)。⑤以接種環(huán)自交界處取出一環(huán)菌液，輕放在加有3 ～4 ml 水的小碟表面，使細(xì)菌自由分散，浮在表面，靜置在溫箱內(nèi)4 ～5 分鐘。⑥ 用接種環(huán)自液面取一環(huán)菌液，放在高度潔凈無油的載玻片上， 切勿研磨和搖動(dòng)。置37 ℃溫箱內(nèi)讓其自干，不能以火焰固定。⑦滴加染液染色0．5 至1 分鐘，水洗，待干鏡檢。
（3) 結(jié)果：菌體鞭毛均呈紅色。
（4) 注意事項(xiàng)：①鞭毛染色的細(xì)菌需新鮮的培養(yǎng)物。②涂片的制作不可用接種環(huán)轉(zhuǎn)動(dòng)涂抹，應(yīng)將細(xì)菌輕輕加在玻片上，防止鞭毛脫落。③載玻片要求高度潔凈。
11．負(fù)染色法
本法使背景著色而菌體不著色。用以觀察細(xì)菌及某種真菌的莢膜。
（1) 墨汁染色：用接種環(huán)取一環(huán)菌液（108 ～1010／ml) 放在潔凈載玻片上， 然后在相距2 ～3 m m 處放已稀釋2 ～3 倍的繪圖用墨汁—接種環(huán)。覆蓋蓋玻片后鏡檢。也可將墨汁1 滴與待檢標(biāo)本1 滴混合于載玻片上的一端， 以作血膜推片的方法制片， 干后鏡檢。可見背景成黑褐色，菌體無色。
（2) 剛果紅染色：在載玻片上置2 ％剛果紅水溶液1 小滴， 以極少量的培養(yǎng)菌與其混合，涂成均勻厚片，待干，以1 ％鹽酸乙醇洗滌，待自然干燥后鏡檢。可見背景為藍(lán)色，菌體無色。
