抗體產(chǎn)生細(xì)胞（Antibody – producing cell)即光鏡下所見(jiàn)漿細(xì)胞。有的呈圓形，核居中（稱(chēng)之為淋巴樣漿細(xì)胞、幼漿細(xì)胞或過(guò)渡型漿細(xì)胞)，也有的呈橢圓形，核偏于一邊（稱(chēng)為典型漿細(xì)胞)。它們都具有豐富胞漿（HE染色呈紅色)，能產(chǎn)生和分泌各種抗體。一個(gè)成熟漿細(xì)胞只能分泌一種抗體。胃腸道粘膜中的各種抗體多由局部抗體產(chǎn)生細(xì)胞所分泌。一般認(rèn)為骨髓的多潛能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成細(xì)胞表面具有IgM和IgD標(biāo)記的成熟B淋巴細(xì)胞后進(jìn)入粘膜層或粘膜下層的散在淋巴濾泡或Peyer斑的生發(fā)中心。胃腸腔內(nèi)抗原通過(guò)其靠腔面的M細(xì)胞進(jìn)入粘膜固有層，通過(guò)巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞將抗原加工后傳遞至生發(fā)中心，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(β-trans－forming growth factor, TGF-β)、IL-4、IL-5、γ-IFN和抗原刺激下B淋巴細(xì)胞增殖并轉(zhuǎn)移化成細(xì)胞表面含IgG、IgA、IgE等特異性B淋巴母細(xì)胞，一部分直接分散在固有層，大部分經(jīng)淋巴細(xì)胞再循環(huán)返回胃腸道粘膜，在IL-2和IL-6刺激下轉(zhuǎn)化成抗體產(chǎn)生細(xì)胞，分泌特異抗體，發(fā)揮體液免疫反應(yīng)。因此測(cè)定粘膜中抗體產(chǎn)生細(xì)胞的分布對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)局部體液免疫反應(yīng)與胃腸道疾病的關(guān)系有重要意義。
抗體產(chǎn)生細(xì)胞胞漿內(nèi)含有相對(duì)多的抗原，故采用直接或間接法免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可簡(jiǎn)化步驟，節(jié) 省時(shí)間，降低成本。為了清除組織間彌散的免疫球蛋白，我們?cè)诠潭ㄇ坝肞BS浸洗，取得良好的效果。m.f1411.cn/shiti/用雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)可以在同一張切片上顯示出兩種不同的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
1．組織加工根據(jù)研究目的的內(nèi)窺鏡直視下鉗取胃、小腸或結(jié)腸粘膜。將取得的組織立即放入含4℃，pH7.2、0.01mol/l PBS燒杯內(nèi)攪拌10～18h后直接放入4℃、96%乙醇中固定。在4℃環(huán)境下繼續(xù)脫水和透明，56℃浸蠟和包埋，石蠟塊冰箱保存。組織切片后，37℃溫水展平，載片后干燥，裝干燥盒置于冰箱，可以保存1周左右。4℃脫蠟和脫二甲苯，PBS洗滌后蒸餾水清洗，風(fēng)干待染。
2．熒光素標(biāo)記抗體 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocynate, FITC)標(biāo)記抗體的具體步驟詳見(jiàn)第三章 。在標(biāo)記絡(luò)丹明B200（lissamine rhodamin B200,RB200)時(shí)應(yīng)注意：
（1)PCI5極易吸收水份放出煙霧樣刺激氣體，RB200和丙酮混合后攪拌時(shí)也放出有毒的SO2Cl刺激性氣體，故操作時(shí)最好在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。在室外操作時(shí)應(yīng)戴口罩。
（2)丙酮極易揮發(fā)，一定要在密閉容器（如帶蓋的青霉素瓶)內(nèi)攪拌。吸取丙酮時(shí)也要?jiǎng)幼餮杆佟?/p>
（3)在標(biāo)記過(guò)程中，RB200能產(chǎn)生HCl，容易使蛋白變性，必須用較多堿性緩沖液中和。具體步驟是：
①按50mg蛋白需10mg RB200和20mg PCI5的比例分別準(zhǔn)確稱(chēng)取PCl5和RB200，放入青霉瓶?jī)?nèi)。經(jīng)橡皮塞穿入玻棒拌混合5min。
②用吸管吸取0.5ml左右丙酮迅速注入瓶?jī)?nèi)，繼續(xù)攪拌5min形成紫褐色溶液（A液)。
③1份抗血清（含蛋白10～20mg/ml)用等量或2份0.5mol/l p9.5碳酸緩沖液稀釋后在4℃冰箱內(nèi)用磁力攪拌器邊攪邊加入A液，并用混合液反復(fù)沖洗青霉素瓶?jī)?nèi)的A液，直至干凈為止，然后繼續(xù)攪拌30～60min。
④稱(chēng)取相當(dāng)于蛋白半量的活性碳加入混合液內(nèi)繼續(xù)攪拌60min后，以4000r/min離心30min除去活性碳。
⑤用30%～50%飽和硫酸銨鹽析1次，去上清液，沉淀物用少量PBS溶解，過(guò)G-25層析柱去除硫酸銨即得RB200標(biāo)記的抗體。
⑥RB200的最大吸收光譜為570。用分光光度計(jì)分別測(cè)定570nm（RB200)和280nm（蛋白)的讀數(shù)，根據(jù)Wells表算出F/P克分子比值。
⑦效價(jià)高的標(biāo)記抗體加0.1% NaN3或硫柳汞（0.1%)數(shù)滴防腐，分裝放置20℃以下可長(zhǎng)期保存，4℃～10℃能保存半年左右。
3．染色步驟染色前進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)、吸收試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)，測(cè)定抗體的純度和特異性，同時(shí)以瓊脂擴(kuò)散和染色效果確定工作效價(jià)。在連續(xù)切片中，用RB200標(biāo)記的IgG稀釋液分別與FITC標(biāo)記的IgA和IgM混合（根據(jù)染色效價(jià)，分別以對(duì)方為稀釋液)進(jìn)行染色。在37℃溫盒內(nèi)孵育45min，PBS清洗，過(guò)一次蒸餾水后風(fēng)干，50%緩沖甘油封片，在冰箱中可保存10天左右。
4．陽(yáng)性結(jié)果觀察及細(xì)胞計(jì)數(shù)用Olympus熒光顯微鏡觀察。選擇BG12激發(fā)濾板和0515抑制濾板可同時(shí)觀察兩種熒光。胞漿豐富、明顯綠色熒光、核不著色的細(xì)胞為IgA或IgM產(chǎn)生細(xì)胞；胞漿紅色熒光者為IgG產(chǎn)生細(xì)胞。少數(shù)胞漿黃色熒光的細(xì)胞核呈圓形，位于細(xì)胞中央，可能這些B淋巴母細(xì)胞能產(chǎn)生兩種抗體，也可能是具有共同的輕鏈而引起的交叉反應(yīng)。如果用α、β、γ、μ、δ等重鏈單抗進(jìn)行研究，可以進(jìn)行鑒別。在熒光顯微鏡下數(shù)出組織切片中陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)（N)，測(cè)微器放在目鏡下測(cè)出組織切片所占小方格數(shù)（P)。測(cè)微器小方格邊長(zhǎng)為0.5mm,根據(jù)物鏡放大倍數(shù)（4倍)用公式D=64N/P計(jì)算出每平方毫米組織切片中所含細(xì)胞數(shù)。
抗體產(chǎn)生細(xì)胞主要分布在粘膜固有層。IgA產(chǎn)生細(xì)胞多沿上皮層分布，IgG和IgM產(chǎn)生細(xì)胞分布全固有層。小腸粘膜含抗體產(chǎn)生細(xì)胞增多，胃和結(jié)腸其次，食管最少。小腸粘膜中IgA、IgM、IgG產(chǎn)生細(xì)胞比例為81.9:15.7:2.5,IgA產(chǎn)生細(xì)胞最多，IgG產(chǎn)生細(xì)胞最少。結(jié)腸粘膜中抗體產(chǎn)生細(xì)胞分布與小腸相似，但I(xiàn)gM和IgG產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)增加。對(duì)于胃粘膜各家報(bào)道不一。多數(shù)認(rèn)為IgA產(chǎn)生細(xì)胞最多，IgG產(chǎn)生細(xì)胞其次，IgM產(chǎn)生細(xì)胞最少，胃體和胃竇無(wú)顯著差異。我們的結(jié)果與國(guó)外報(bào)道一致。正常胃腸粘膜中IgD產(chǎn)生細(xì)胞極少，IgE產(chǎn)生細(xì)胞僅占2%，胃粘膜中多于結(jié)腸粘膜。這些抗體產(chǎn)生細(xì)胞分泌的抗體在粘膜局部免疫起著極其重要的作用。某些消化道疾病與抗體產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)量、分布和比例的異常密切相關(guān)。
1．抗體產(chǎn)生細(xì)胞與胃部疾病70年代國(guó)外就重視慢性胃炎和胃潰瘍組織中抗體產(chǎn)生細(xì)胞研究。多數(shù)報(bào)道認(rèn)為表淺性胃炎以IgA和IgM產(chǎn)生細(xì)胞增加為主，輕度萎縮性胃炎以IgA產(chǎn)生細(xì)胞增多，可能與細(xì)菌或病毒等感染有關(guān)。中度以上萎縮性胃炎和惡性貧血病人胃粘膜中IgG產(chǎn)生細(xì)胞顯著增加。部分病人有壁細(xì)胞、胃泌素細(xì)胞、內(nèi)因子或胃組織其它成分的自身抗體。IgG產(chǎn)生細(xì)胞增加可能與特異性免疫反應(yīng)有關(guān)m.f1411.cn/job/。有人將壁細(xì)胞抗體陽(yáng)性病人胃粘膜中分離出IgG與壁細(xì)胞共同培養(yǎng)，能直接破壞壁細(xì)胞。我們的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，中度以工萎縮性胃炎患者胃粘膜中T淋巴細(xì)胞和IgG產(chǎn)生細(xì)胞均增加，提示胃粘膜的萎縮不能排除抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒（ADCC)作用的結(jié)果。部位原發(fā)性變異性低丙種球蛋白血癥患者整個(gè)胃粘膜萎縮，粘膜中缺乏抗體產(chǎn)生細(xì)胞。對(duì)于胃潰瘍，有人認(rèn)為IgA、IgM和IgG產(chǎn)生細(xì)胞均增加，它們之間的比例是相對(duì)正常的，但I(xiàn)gE產(chǎn)生細(xì)胞明顯增加（是正常人的10倍)。用放射免疫法測(cè)定也發(fā)現(xiàn)胃潰瘍病人血清和胃液中IgE濃度也增高。推測(cè)IgE作用于肥大細(xì)胞后釋放組織胺類(lèi)物質(zhì)在潰瘍的病因中起重要作用。
2．抗體產(chǎn)生細(xì)胞與胃腸道惡性腫瘤1977年日本奧田晃三首次用免疫熒光法對(duì)89例進(jìn)展期胃癌的抗體產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)IgA、IgG和IgM產(chǎn)生細(xì)胞均明顯減少，且與胃癌的分型和組織分類(lèi)無(wú)關(guān)。我們對(duì)48例胃癌組織用雙標(biāo)記免疫熒光研究發(fā)現(xiàn)癌組織中IgA產(chǎn)生細(xì)胞顯著減少，但I(xiàn)gG產(chǎn)生細(xì)胞顯著增加，并有聚集現(xiàn)象；癌旁組織中抗體產(chǎn)生細(xì)胞增加更顯著，其中IgG產(chǎn)生細(xì)胞增加6.2倍，腸型胃癌中IgG產(chǎn)生細(xì)胞顯著多于胃型胃癌，腫塊越大則IgG產(chǎn)生細(xì)胞越少。Jonder證實(shí)人類(lèi)腫瘤細(xì)胞膜上有IgG的FC受體。有人將小白鼠腫瘤組織中的IgG提取證實(shí)為IgG2，在細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)癌細(xì)胞有殺傷作用。提示IgG產(chǎn)生細(xì)胞與抗胃癌免疫反應(yīng)密切相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)胃癌組織中IgA產(chǎn)生細(xì)胞只占28.5%，癌旁占40.2%，顯著低于正常（55.1%)。IgA產(chǎn)生細(xì)胞減少可導(dǎo)致SIgA合成減少，引起粘膜免疫屏障功能失調(diào)。也有人認(rèn)為腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生某種抑制因子阻礙IgA產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)入癌組織內(nèi)。其確切機(jī)理仍在深入研究中。近年來(lái)，對(duì)腸癌組織中抗體產(chǎn)生細(xì)胞研究也有報(bào)道。發(fā)現(xiàn)癌組織中IgA產(chǎn)生細(xì)胞也顯著減少，癌旁組織中IgG產(chǎn)生細(xì)胞增加13倍。認(rèn)為與結(jié)腸癌特異性抗原或IgG的細(xì)胞毒作用密切相關(guān)。今后的研究在于從組織中分離出抗體的特異性部分在體外或體內(nèi)直接作用于腫瘤細(xì)胞，篩選出能破壞癌細(xì)胞的抗體及其基因組，用分子生物學(xué)技術(shù)擴(kuò)增，用于腫瘤的治療。
3．抗體產(chǎn)生細(xì)胞與炎癥性腸病慢性潰瘍性結(jié)腸炎（CUC)和克隆氏病是病因未明的腸道感染性疾病。近年來(lái)有人發(fā)現(xiàn)炎癥性腸病與腸道局部免疫反應(yīng)有關(guān)。Golzayd等發(fā)現(xiàn)9例CUC腸粘膜中6例有大量IgA產(chǎn)生細(xì)胞浸潤(rùn)，認(rèn)為可能與細(xì)菌或病毒感染有關(guān)。也有人發(fā)現(xiàn)以IgG產(chǎn)生細(xì)胞或IgE產(chǎn)生細(xì)胞浸潤(rùn)為主。Persson等報(bào)道克隆氏病的回盲部IgA產(chǎn)生細(xì)胞減少，IgG和IgM產(chǎn)生細(xì)胞增加，有人發(fā)現(xiàn)感染嚴(yán)重部位IgG產(chǎn)生細(xì)胞增加，粘膜完整部位IgM產(chǎn)生細(xì)胞最多。因此有人提出IgG和IgM能調(diào)節(jié) 局部T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)造成粘膜損傷，潰瘍是IgE調(diào)節(jié) 的組織胺類(lèi)物質(zhì)釋放過(guò)多和繼發(fā)感染引起。也有人提出炎癥性腸病雖然腸粘膜中抗體產(chǎn)生細(xì)胞增加，但細(xì)胞比例沒(méi)有改變。因此炎癥性腸病與體液免疫反應(yīng)的關(guān)系仍需要進(jìn)一步深入研究。
4．抗體產(chǎn)生細(xì)胞與慢性腹瀉慢性腹瀉是消化道常見(jiàn)病，粘膜免疫功能缺陷是重要原因之一。目前認(rèn)為，不論體液免疫和細(xì)胞免疫缺陷，均可引起腹瀉同時(shí)伴有腸道鞭毛蟲(chóng)、念球菌和霉菌等繼發(fā)感染，這些病人胃腸道粘膜缺乏抗體產(chǎn)生細(xì)胞。雖然部分病人仍有IgGT和IgM產(chǎn)生細(xì)胞分布，但I(xiàn)gA產(chǎn)生細(xì)胞顯著減少或缺如�？梢�(jiàn)IgA產(chǎn)生細(xì)胞在胃腸粘膜中起重要保護(hù)作用。也有人發(fā)現(xiàn)病人胃腸粘膜有不典型抗體產(chǎn)生細(xì)胞，產(chǎn)生的抗體很少，可能與缺乏輔助性T淋巴細(xì)胞有關(guān)。對(duì)這類(lèi)病人除給予必要的抗菌素控制繼發(fā)感染外，定期補(bǔ)充免疫球蛋白制劑或適當(dāng)使用左旋咪唑和轉(zhuǎn)移因子等T淋巴細(xì)胞激活劑可能使癥狀得到緩解。已經(jīng)有人從乳汁中提取分泌性IgA治療頑固性小兒腹瀉獲得成功。α-重鏈病患者小腸粘膜固有層大量抗體產(chǎn)生細(xì)胞浸潤(rùn)，分泌α-重鏈，引起腸粘膜萎縮，也能導(dǎo)致吸收不良和腹瀉等癥狀。
