動(dòng)脈血管壁膠原提取的基本方法是，首先除去凝血等其他雜質(zhì)，由于膠原為桿狀三螺旋結(jié)構(gòu)，能耐受胃蛋白酶的作用，但是兩端球蛋白結(jié)構(gòu)能被胃蛋白酶水解。膠原纖維內(nèi)分子間的共價(jià)交聯(lián)是由分子末端賴氨酸或羥賴氨酸形成，用胃蛋白酶切斷末端交聯(lián)結(jié)構(gòu)，使膠原分子的巨形結(jié)構(gòu)被破壞，從完整分子可提出各種類型的膠原。
（一)膠原的初步分離
1．小心取出動(dòng)脈血管，用0.05mol/L BPS pH7.8洗凈凝血塊，3kr/min離心10min。
2．冷丙酮酸浸泡24h除去脂肪，蒸餾水洗滌3次。
3．將組織破碎，加三倍體積組織勻漿處理液（0.5mol/L乙酸，pH2.5，1%胃蛋白酶)于4℃48h,16kr/min離心45min，同樣方法重復(fù)3次。
4．向留取的上清液中緩緩加入NaCl，最終達(dá)到4mol/L濃度，攪拌12～24h，15kr/min離心45min，棄上清。
5．進(jìn)一步分離各種膠原可用分段鹽析和柱層析法進(jìn)行操作。
（二)膠原的分段鹽析
1．取初級(jí)提取物加0.1mmol/L乙酸，加NaCl至0.7mmol/L，15kr/min離心20min。沉淀提�、�、Ⅲ、Ⅳ型膠原，上清提�、�、Ⅴ型膠原。
2．沉淀，加0.14mol/L PBS pH7.6,37℃保濕16h，10kr/min離心20min，上清液加NaCl至4mol/L，離心，沉淀物為Ⅳ型膠原。
3．1mol/L NaCl溶解沉淀，加3倍體積Tris-HCl pH7.4，10kr/min離心20min，沉淀為Ⅲ型膠原。
4．上清加NaCl至2.5mol/L,10kr/min離心20min，沉淀為Ⅰ膠原。
5．取1.操作的上清加NaCl至1.2mol/L,15kr/min離心20min。
6．沉淀溶于4倍體積1.0mol/L NaCl、0.05mol/l Tris-HCl pH7.4，加NaCl至4mol/L 10kr/min離心20min。
7．上清加NaCl至4mol/L，調(diào)pH到3.5,離心得沉淀再加5倍體積0.2mol/l NaCl、1mol/L脲、0.01mol/L Tris-HCl pH7.4的DEAE液懸浮16h，小心取上清加NaCl至4mol/L，10kr/min離心10min，沉淀為Ⅳ型膠原。
8．將6.沉淀部分加0.2mol/LNaCl,10.05mol/l Tirs-HCl pH7.4的DEAE懸浮16h，上清加NaCl至4mol/l,10kr/min離心10min，沉淀為Ⅴ型膠原。
（三)將初步提取的膠原加到DEAE纖維柱上，用0.2mmol/l NaCl、0.05mol/L Tris-HCl pH7.5的溶液洗脫，230nm波長(zhǎng)檢測(cè)洗脫物。因?yàn)槟z原在pH7.5時(shí)均帶正電荷，不與DEAE柱結(jié)合，所以被柱結(jié)合的則為非膠原蛋白。
蛋白多糖具有可溶于4mol/L鹽酸胍的性質(zhì)，再經(jīng)DEAE-纖維素層析除去其他雜質(zhì)，非蛋白多糖與蛋白多糖用不同濃度尿素可分段層析分開(kāi)。
1．取動(dòng)脈血管小心除去血管周圍脂肪組織和纖維膜，用冷0.5mol/l PBS pH7.8洗滌，2kr/min離心10min。
2．用勻漿器破碎，加入15倍體積的提取液（0.05mol/L乙酸pH5.8、4.0mol/L鹽酸胍、0.1mol/l6-氨基乙酸EDTA、3mol/L芐脒)，于4℃緩慢振蕩24h，10kr/min離心30min。
3．取上清透析濃縮30倍。
4．將提取液加入已經(jīng)平衡好的DEAE-纖維素柱上，分別用0.15mol/l NaCl和2mol/LNaCl洗脫，均用280nm波長(zhǎng)紫外監(jiān)測(cè)儀連續(xù)監(jiān)測(cè)。
提取方法較多，各有優(yōu)缺點(diǎn)。1969年Bornstein和Ross先用5mol/L鹽酸胍抽提，再用膠原酶水解其他非彈性蛋白組分，最后還原二硫鍵，分離提取彈性蛋白。具體方法如下：
1．將動(dòng)脈血管壁洗凈，小心除去附著結(jié)締組織。
m.f1411.cn/sanji/2．將血管壁組織浸于4℃ 50%的吡啶液，破碎組織，3kr/min離心15min。
3．取沉淀用蒸餾水洗滌3次，真空干燥后研成粉末。
4．將粉末懸浮于2mol/L NaCm.f1411.cn/shiti/l,4℃攪拌24h，3kr/min離心20min，棄上清，沉淀用蒸餾水洗3次。
5．將沉淀用無(wú)水乙醇脫脂20min，用氯仿-甲醇（2：1)處理20min，再用乙醚沖洗干燥，3kr/min離心20min，真空干燥沉渣。
6．干燥的沉淀物用5倍處理液（0.5mol/LCaCl2、10.05mol/l Tris-HClpH7.5、2%膠原酶)洗滌，3kr/min離心20min。
7．將沉淀移入帶塞的瓶中，加含0.5mol/L鹽酸胍、0.1mol/l Tris-HClpH8.5、0.05mol/L二硫赤蘚糖醇，2.0mol/L EDTA液4℃過(guò)夜。
8．3kr/min離心20min，沉淀用蒸餾水洗滌2次。
9，沉淀物加入處理液（6mol/L尿素、0.1%SDS、0.05mol/L二硫赤蘚糖醇、0.05mol/l Tris-HCl pH7.7)，通過(guò)氮氧真空過(guò)夜，3kr/min離心20min。
10．沉淀再真空干燥，即為彈性蛋白。
提取粘連蛋白的基本原理是用NaCl脫氧膽酸鈉液提取血管壁中的粘連蛋白，再用高鹽除去雜質(zhì)，然后進(jìn)一步用Sephacryl層析純化，方法如下：
1．將動(dòng)脈血管壁組織加10倍體積處理液（0.05mol/lTris-HCL pH7.6、0.5%核酸酶)，4℃攪拌20min，10kr/min離心10min。
2．沉淀用含0.05mol/L Tris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、10%甲醇液，洗滌2次，10kr/min離心10min。
3．沉淀物中，加40倍體積處理液（0.05mol/lTris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、0.5mol/LNaCl,)4℃過(guò)夜后，10kr/min離心10min。
4．上清用PEG6000濃縮，最后加入已平衡好的SephacrylS-3000層析柱上，用0.05mol/L Tris-HCl pH7.6、0.5%NaCl洗脫，第一峰即為粘連蛋白。
