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中國生物制品規(guī)程:結(jié)核菌素純蛋白衍化物(TB-PPD)制造及檢定規(guī)程

本品系用結(jié)核桿菌經(jīng)液體表面培養(yǎng)、蒸汽殺菌過濾除去菌體,用沉淀分離、洗滌及再溶解的提純方法制成的液體或凍干制品,含有從結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液中獲得的活性物質(zhì),其主要成分是蛋白質(zhì),對已受結(jié)核菌感染或曾接受卡介苗免疫的機體,能引起特異的皮膚變態(tài)反應(yīng)。用于檢查結(jié)核…

本品系用結(jié)核桿菌經(jīng)液體表面培養(yǎng)、蒸汽殺菌過濾除去菌體,用沉淀分離、洗滌及再溶解的提純方法制成的液體或凍干制品,含有從結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液中獲得的活性物質(zhì),其主要成分是蛋白質(zhì),對已受結(jié)核菌感染或曾接受卡介苗免疫的機體,能引起特異的皮膚變態(tài)反應(yīng)。用于檢查結(jié)核桿菌的感染及觀察免疫反應(yīng)。

1 菌種

1.1 菌種由中國藥品生物肉制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。

1.2 制造TB-PPD用人型結(jié)核桿菌,菌號93009(H37Rv)。菌種應(yīng)有完整的歷史資料,經(jīng)過全面檢定,凍干保存。

1.3 應(yīng)制備生產(chǎn)用菌種批,次級菌種批應(yīng)控制在5代以內(nèi)。

2 m.f1411.cn制造

全部生產(chǎn)過程,包括殺死分枝桿菌,應(yīng)在完全隔離的區(qū)域內(nèi)用專用設(shè)備進行。

2.1 制造用培養(yǎng)基

使用蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基,改良蘇通綜合培養(yǎng)基,或其他適宜培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中應(yīng)不含已知能對人或動物造成毒性和變態(tài)性反應(yīng)的成分。

2.2 啟開菌種(菌種批)反接種于蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基上。置37℃培養(yǎng)2~3周,可在蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基上再傳一代或直接挑取蘇通馬鈴薯管內(nèi)生長良好的菌膜,移種于改良蘇通綜合培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基的表面,置37℃靜止培養(yǎng)1~2周,供大量接種用。

2.3 大量接種

挑取發(fā)育良好的菌膜移種于改良蘇通綜合培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基的表面,置37℃靜止培育8~10周。凡在培養(yǎng)期間或培養(yǎng)終止時,有菌膜下沉、發(fā)育異;蛭廴倦s菌者,必須廢棄。

2.4 殺菌

培養(yǎng)終止,將培養(yǎng)物加熱,121℃30分鐘進行殺菌處理。

2.5 除菌

殺菌后用濾器除去菌膜及菌體,收集濾液并取樣做無菌試驗,然后,加入0.3%苯酚或其他適宜的防腐劑。濾液保存在4~8℃,但要防止凍結(jié)。

2.6 提純

用三氯乙酸和飽和硫酸銨法分別沉淀蛋白,加壓過濾除去清液,并收集沉淀物于3μm孔徑的濾膜上,然后用10%氯化鈉液洗酸脫鹽至中性為止,最后以磷酸鹽緩沖液將沉淀物溶解,除菌過濾后即為原液。亦可采用其他適宜方法提純。

2.7 分批

每次提純的原液作為1亞批。最多將5個亞批混合組成為1批。

2.8 半成品檢定

2.8.1 物理檢查

原液應(yīng)為深棕色的澄明液體,不應(yīng)有沉淀物或其他雜質(zhì)。

2.8.2 無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

2.8.3 安全試驗

用體重300~400g健康豚鼠2只,每只腹腔注射原液1.0ml,觀察6周,檢查其癥征或死亡。所有在試驗后24小時內(nèi)死亡的或表現(xiàn)出癥征的動物應(yīng)作鏡檢,然后將有關(guān)的組織鏡檢和培養(yǎng),檢查其有無分枝桿菌存在的證據(jù)。觀察期中活存的動物也要以同樣方法檢查。

如果分析桿菌活菌培養(yǎng)試驗陰性,在觀察期中全部豚鼠健康存活,無一動物出現(xiàn)分枝桿菌的癥征,則可判定濃縮原液通過試驗。

如果未到觀察期,任何動物死于非結(jié)核病因,本試驗可復(fù)試一次。

2.8.4 致敏效應(yīng)試驗

實驗組與對照組分別用體重300~400g未做過任何試驗的健康豚鼠各3只,實驗組每只豚鼠皮內(nèi)注射0.1ml含500IUTB—PPD樣品,共3次,每次間隔5天,在第3次注射后15天,實驗組與對照組每只豚鼠各皮內(nèi)注射0.1ml含500IUTB—PPD樣品,連續(xù)觀察3天,兩組動物反應(yīng)不應(yīng)有明顯區(qū)別。

2.8.5 純度測定

應(yīng)測定蛋白(凱氏定氮法)、多糖(蒽酮法)與核酸(紫外分光光度法)含量。蛋白含量應(yīng)≥90%,多糖含量≤3%。

2.8.6 效價測定

TB—PPD標準品由中國藥品生物制品檢定所提供。

2.8.6.1 動物試驗

將標準品及待檢原液分別稀釋馬0.1ml含100IU、20IU及4IU或其他適宜的稀釋度,用體重400~600g已致敏的白色雌性豚鼠最少4只,去毛后于背部脊柱兩側(cè)相對部位,分別皮內(nèi)注射上述稀釋度各0.1ml(從尾側(cè)起先注射稀釋度最高者)。于注射后24、48小時各觀察結(jié)果1次(可根據(jù)48小時的反應(yīng)結(jié)果判定),算出待檢和標準TB-PPD的平均硬結(jié)反應(yīng)(縱橫直徑相加除2)計算累計值,并求其比值,比值1±0.2者為合格。

也可按WHO規(guī)程要求,標準品及待檢樣品分別稀釋3個不同的適宜稀釋度,用6只致敏豚鼠,以輪圈法注射于豚鼠背部兩則,每側(cè)3點,每點皮內(nèi)注射0.1或0.2ml樣品,用雙法分別記錄24及48小時局部硬結(jié)的縱徑與橫徑。計算每個稀釋度2天的總和(也可計算2天的平均面積),并求其比值,比值1±0.2者為合格。

稀釋度的選擇應(yīng)能使注射后24小時所產(chǎn)生的局部硬結(jié)反應(yīng)直徑不小于8mm,不大于25mm,兩個樣品的反應(yīng)直徑大致相同及兩個樣品的3個稀釋度的劑量對數(shù)反應(yīng)線應(yīng)基本平行。

如待檢樣品效價與標準品效價不一致,可用同樣方法重試一次,并算出相當于標準品的效價進行調(diào)整,調(diào)整后再重新抽樣測定效價,直至合格。

2.8.6.2 人體反應(yīng)測定

動物試驗合格后,應(yīng)進行小量人體測定,選擇對TB—PPD1IU(好0.02μg結(jié)m.f1411.cn/zhicheng/核蛋白)反應(yīng)陽性的敏感成人最少5人或者皮內(nèi)接種卡介苗12周后免疫效果觀察的嬰幼兒至少20人,每人于兩前臂內(nèi)側(cè)相對部位分別注射5IU的標準品與待檢樣品各0.1ml,注射后72小時觀察結(jié)果,并求其比值(計算方法與2.8.6.1項相同)。比值1±0.2,并無1例異常反應(yīng)者為合格。

2.9 分裝凍干

經(jīng)物理檢查、無菌試驗、安全試驗、致敏效應(yīng)試驗、蛋白質(zhì)含量及效價測定合格后,即可根據(jù)蛋白質(zhì)含量將原液進行定量稀釋至規(guī)定濃度,然后定量分裝安瓿,每安瓿裝量為0.5ml,分裝后立即進行凍干。每安瓿的分裝誤差應(yīng)符合標準品的要求(差異系數(shù)不超過1%)。

凍干后抽樣做成品檢定,亦可將原液保存?zhèn)溆谩?/p>

3 濃縮物檢定

3.1 物理檢查

凍干TB—PPD應(yīng)為白色疏松體,無融化跡象。加入稀釋液后,應(yīng)于3分鐘內(nèi)全部溶解,呈棕黃色澄明液體,不得有不容物或雜質(zhì)。

如系液體原液,亦應(yīng)為棕黃色澄明液體,不應(yīng)有不溶物或雜質(zhì)。

3.2 水分測定

凍干制品水分含量應(yīng)≤3%。

3.3 無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

3.4 安全試驗

按2.8.3項進行。

3.5 純度測定

按2.8.5項進行。

3.6 致敏效應(yīng)試驗

按2.8.4項進行。

3.7 效價測定

動物試驗按2.8.6.1項進行。人體反應(yīng)測定按2.8.6.2項進行。但觀察人數(shù)需增加1~2倍。

3.8 保存與效期

保存于2~8℃冷暗處。凍干制品自效價測定合格之日起效期為10年。液體原液自效價測定合格之日起效期為5年。

4 TB—PPD和稀釋

4.1 稀釋

經(jīng)檢定合格的濃縮物用內(nèi)含0.0005%吐溫80及0.3%苯酚的pH7.2~7.4的0.01mol的磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋至20IU或50IU。

各處稀釋用具應(yīng)專用。加入TB—PPD后應(yīng)充分搖勻,并逐瓶抽樣作無菌試驗,合格后分裝。

4.2 分批

每次稀釋的同一濃度的稀釋TB—PPD為一批,同時有數(shù)瓶者,按瓶分為亞批。

4.3 分裝

由專人用專用工具進行。

5 成品檢定

5.1 物理檢查

分裝后應(yīng)進行破漏、裝量、外觀檢查。應(yīng)為無色澄明液體,不得有不容物或雜質(zhì)。

5.2 化學(xué)檢查

pH值應(yīng)為6.8~7.4。苯酚含量應(yīng)為0.25%~0.5%。

5.3 無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

5.4 防腐劑試驗

用體重18~20g小白鼠2只,各皮下注射樣品0.5ml,小白鼠震顫時間不得超過半小時,觀察7天,不得有局部膿腫或死亡。

5.5 安全試驗

每批用體重18~20g小白鼠5只,各腹腔注射樣品0.5ml,觀察1周,小白鼠應(yīng)健康活存。

5.6 效價測定

按2.8.6.1項進行。比值1±0.2者為合格。

6 保存與效期

保存于2~8℃暗處。自稀釋檢定合格之日起效期為1年。

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