一、原理
將抗載脂蛋白血清均勻地混合于瓊脂糖凝膠內(nèi),打孔,加樣?字写郎y樣品的抗原輻射狀向含抗體的膠內(nèi)擴散,至抗原與抗體的量達一定比例時形成可見的沉淀環(huán)。一定條件下沉淀環(huán)的直徑或面積與相應的抗原Apo含量成正比。
二、試劑
1.0.05mol/L pH8.2巴比妥鈉-HCl緩沖液;巴比妥鈉15.8g加水至1000ml。以1.17mol/l HCl調(diào)pH至8.2,約1.17mol/L Hcl(濃HCl 19.3ml加水180.7ml)18.36ml,最后以蒸餾水補足至1421.8ml。
2.24.0g/L瓊脂糖:優(yōu)質(zhì)瓊脂糖粉2.4g,硫柳汞0.01g,加0.05mol/lpH8.2巴比妥鈉HCl緩沖液100ml,加熱融化后,根據(jù)澆注板的大小分裝,每管5.8ml、3.4ml、1.5ml,加塞后4℃或室溫保存。
3.0.1g/L硫柳汞生理鹽水:1000ml生理鹽水中含硫柳汞0.1g。
4.抗血清:臨用前根據(jù)澆注板的大小,按效價稀釋。
三、操作
1.澆注瓊脂糖凝膠板
取“凹”型有機玻璃框架,厚1.6mm,兩邊夾6×12cm玻璃,再用鐵夾夾緊玻璃待用。
加熱融化24.0g/L瓊脂糖,56℃水浴保溫。根據(jù)抗Apo血清效價,按表18-19進行配制。
表18-19 含抗血清瓊脂糖板配制法
試 劑 | 抗 血 清 RID 法 效 價 | |||||
20 | 25 | 30 | 40 | 60 | 80 | |
24m.f1411.cn/yishi/.0g/L瓊脂(ml) | 5.80 | 5.80 | 5.80 | 5.80 | 5.80 | 5.80 |
硫柳汞鹽水(ml) | 5.22 | 5.34 | 5.41 | 5.51 | 5.61 | 5.65 |
抗血清(ml) | 0.58 | 0.46 | 0.39 | 0.29 | 0.19 | 0.15 |
將稀釋的抗血清傾入已融化的瓊脂糖中,顛倒混勻1~2次,避免產(chǎn)生氣泡,迅速澆注預置水平位置的雙層玻板內(nèi),待凝?寡逍r高時,亦可直接將抗血清混入12.0g/L瓊脂中,搖勻后制板。
2.按模式圖用直徑3mm的金屬管打孔,6×12cm免疫擴散板打孔28個,6×8cm免疫擴散板打孔16個。
3.待測血清用硫柳汞鹽水稀釋(按說明書),用微量加樣器每份標本加1孔。加樣量10μl。置濕盒(水平位置)37℃擴散24h,測沉淀環(huán)直徑,如圖18-2所示。
圖18-2 單向免疫擴散圖(0.8%瓊脂糖)
4. 標準曲線的制備(參考方法)
(1)參考m.f1411.cn血清稀釋法:取Apo含量標準參考血清用鹽水稀釋成梯度濃度。ApoAⅠ:20、40、60、80、100mg/dl,同上法操作加樣,每一稀釋濃度應在兩塊板的不同位置各加樣孔,每孔5μl。37℃濕盒擴散24h,測沉淀環(huán)直徑,求出各稀釋度均值。制作標準曲線。
(2)用半對數(shù)紙制作:以抗原含量為縱坐標(對數(shù)),沉淀環(huán)直徑為橫坐標,在半對數(shù)紙上作圖。一般要求至少有4個不同稀釋度。增加標準曲線上的點數(shù);可增加其可靠程度。
(3)用推算平均值法制備標準曲線:RID定量法盡管嚴格遵守所有的試驗條件,但不同濃度所求得的沉淀環(huán)直徑,在繪制曲線時仍然常不在一條直線上,推算平均值法是通過數(shù)學方法處理,使不在標準曲線上的各點回歸到同一直線上來?捎霉絣og y=ax+b表示。
結(jié)果判斷
根據(jù)待測血清在含抗Apo血清免疫擴散板上形成的沉淀環(huán)直徑,查標準曲線即可行相應Apo的含量。可以mg/dl報告,也可以國際單位報告(g/L)