醫(yī)學(xué)微生物學(xué):第二節(jié)　外界因素對細(xì)菌的影響

細(xì)菌在自然界必然不斷經(jīng)受周圍環(huán)境中各種因素的影響。當(dāng)環(huán)境適宜時，細(xì)菌能進行正常的新陳代謝而生長繁殖；若環(huán)境條件變化，可引起細(xì)菌的代謝和其他性狀發(fā)生變異；若環(huán)境條件改變劇烈，可使細(xì)菌生長受到抑制或?qū)е滤劳�。因此掌握微生物對周圍環(huán)境的依賴關(guān)系，在醫(yī)療實踐中，一方面可創(chuàng)造有利條件，促進微生物的生長繁殖，從病理材料中分離培養(yǎng)病原微生物，有助于傳染病的診斷以及制備疫苗，來預(yù)防某些傳染�。涣硪环矫�，也可利用環(huán)境對細(xì)菌不利因素，抑制或殺滅病原微生物，以達到消毒滅菌的目的。本節(jié)重點介紹外界環(huán)境對細(xì)菌不利因素，提高對消毒滅菌的認(rèn)識以便在實際工作中加以應(yīng)用。

消毒（Disinfection)殺滅病原微生物的方法。用以消毒的藥物稱為消毒劑(Disinfectants)一般消毒劑在常用濃度下，只對細(xì)菌繁殖體有效。對于芽胞則需要提高消毒劑的濃度和延長作用的時間。

滅菌（Sterilization)殺滅物體上所有的微生物（包括病原體和非病原體的繁殖體和芽胞)的方法。因此，滅菌比消毒的要求高；但在日常生活中，消毒和滅菌這兩個術(shù)語往往通用。

無菌（Asepsis)物體上或容器內(nèi)無活菌存在的意思。無菌操作是防止微生物進入機體或其他物品的操作技術(shù)。例如，進行外科手術(shù)或微生物學(xué)實驗時，須注意無菌操作。

防腐（Antisepsis)防止或抑制微生物生長繁殖的方法。用于防腐的化學(xué)藥物稱為防腐劑。許多藥物在低濃度時只有　抑菌作用，濃度增高或延長作用時間，則有殺菌作用。

消毒與滅菌技術(shù)的選擇，取決于多種因素。在實際工作中應(yīng)根據(jù)消毒滅菌的對象和目的要求不同，以及條件的不同，選擇不同的合適方法。

一、物理因素

各種物理因素對細(xì)菌都能產(chǎn)生一定的影響作用。

（一)熱力滅菌

高溫對細(xì)菌有明顯的致死作用。熱力滅菌主要是利用高溫使菌體變性或凝固，酶失去活性，而使細(xì)菌死亡。但是，更細(xì)微的變化已發(fā)生于細(xì)菌凝固之前。有人認(rèn)為DNA單螺旋的斷裂可能是主要的致死因素。細(xì)菌蛋白質(zhì)、核酸等化學(xué)結(jié)構(gòu)是由氫鍵連接的，而氫鍵是較弱的化學(xué)鍵，當(dāng)菌體受熱時，氫鍵遭到破壞，蛋白質(zhì)、核酸、酶等結(jié)構(gòu)也隨之被破壞，失去其生物學(xué)活性，與細(xì)菌致死有關(guān)。此外，高溫亦可導(dǎo)致胞膜功能損傷而使小分子物質(zhì)以及降解的核糖體漏出。干熱的致死作用與濕熱不盡相同，一般屬于蛋白變性、氧化作用受損和電解質(zhì)水平增高的毒力效應(yīng)。

熱力滅菌時最可靠而普遍應(yīng)用的滅菌法，包括濕熱滅菌和干熱滅菌法。

1．濕熱滅菌法

在同樣的溫度下，溫?zé)岬臍⒕�效果比干熱好，其原因有：①蛋白質(zhì)凝固所需的溫度與其含水量有關(guān)，含水量愈大，發(fā)生凝固所需的溫度愈低。濕熱滅菌的菌體蛋白質(zhì)吸收水分，因較大同一溫度的干熱空氣中易于凝固。②溫?zé)釡缇�過程中蒸氣放出大量潛熱，加速提高濕度。因而濕熱滅菌比干熱所要溫度低，如在同一溫度下，則濕熱滅菌所需時間比干熱短。③濕熱的穿透力比干熱大，使深部也能達到滅菌溫度，故濕熱比干熱收效好。

濕熱滅菌法包括有：

（1)煮沸法：煮沸100℃，5分鐘，能殺死一般細(xì)菌的繁殖體。許多芽胞需經(jīng)煮潮5～6小時才死亡。水中加入2%碳酸鈉，可提高其沸點達105℃。既可促進芽胞的殺滅，又能防止金屬器皿生銹。煮沸法可用于飲水和一般器械（刀剪、注射器等)的消毒。

（2)流通蒸汽滅菌法：利用100℃左右的水蒸汽進行消毒，一般采用流通蒸汽滅菌器（其原理相當(dāng)于我國的蒸籠)，加熱15到39分鐘，可殺死細(xì)菌繁殖體。消毒物品的包裝不宜過大、過緊以利于蒸汽穿透。

（3)間歇滅菌法：利用反復(fù)多次的流通蒸汽，以達到滅菌的目的。一般用流通蒸汽滅菌器，100℃加熱15～30分鐘，可殺死其中的繁殖體；但芽胞尚有殘存。取出后放37℃孵箱過夜，使芽胞發(fā)育成繁殖體，次日再蒸一次，如此連續(xù)三次以上。本法適用于不耐高溫的營養(yǎng)物（如血清培養(yǎng)基)的滅菌。

（4)巴氏消毒法（Pasteurization)：利用熱力殺死液體中的病原菌或一般的雜菌，同時不致嚴(yán)重?fù)p害其質(zhì)量的消耗方法。由巴斯德創(chuàng)用以消毒酒精類，故名。加溫61.1～62.8℃半小時，或71.7℃15～30秒鐘。常用于消毒牛奶和酒類等。

（5)高壓蒸汽滅菌法：壓力蒸汽滅菌是在專門的壓力蒸汽滅菌器中進行的，是熱力滅菌中使用最普遍、效果最可靠的一種方法。其優(yōu)點是穿透力強，滅菌效果可靠，能殺滅所有微生物。

目前使用的壓力滅菌器可分為兩類：下排氣式壓力滅菌器和預(yù)真空壓力滅菌器。適用于耐高溫、耐水物品的滅菌。

2．干熱滅菌法

干熱滅菌比濕熱滅菌需要更高的溫度與較長的時間。

（1)干烤：利用干烤箱，加熱160～180℃2小時，可殺死一切微生物，包括芽胞菌。主要用于玻璃器皿、瓷器等的滅菌。

（2)燒灼和焚燒：燒灼是直接用火焰殺死微生物，適用于微生物實驗室的接種針等不怕熱的金屬器材的滅菌。焚燒是徹底的消毒方法，但只限于處理廢棄的污染物品，如無用的衣物、紙張、垃圾等。焚燒應(yīng)在專用的焚燒爐內(nèi)進行。

(3) 紅外線：紅外線輻射是一種0.77～1000微米波長的電磁波,有較好的熱效應(yīng),尤以1～10微米波長的熱效應(yīng)最強。亦被認(rèn)為一種干熱滅菌。紅外線由紅外線燈泡產(chǎn)生,不需要經(jīng)空氣傳導(dǎo)，所以加熱速度快，但熱效應(yīng)只能在照射到的表面產(chǎn)生，因此不能使一個物體的前后左右均勻加熱。紅外線的殺菌作用與干熱相似，利用紅外線烤箱滅菌的所需溫度和時間亦同于干烤。多用于醫(yī)療器械的滅菌。

人受紅外線照射較長會感覺眼睛疲勞及頭疼；長期照射會造成眼內(nèi)損傷。因此，工作人至少應(yīng)戴能防紅外線傷害的防護鏡。

（4)微波：微波是一種波長為1毫米到1米左右的電磁波，頻率較高，可穿透玻璃、塑料薄膜與陶瓷等物質(zhì)，但不能穿透金屬表面。微波能使介質(zhì)內(nèi)雜亂無章的極性分子在微波場的作用下，按波的頻率往返運動，互相沖撞和磨擦而產(chǎn)生熱，介質(zhì)的溫度可隨之升高，因而在較低的溫度下能起到消毒作用。一般認(rèn)為其殺菌機理除熱效應(yīng)以外，還有電磁共振效應(yīng)，場致力效應(yīng)等的作用。消毒中常用的微波有2450MHZ與915MHZ兩種。微波照射多用于食品加工。在醫(yī)院中可用于檢驗室用品、非金屬器械、無菌病室的食品食具、藥杯及其它用品的消毒。

微波長期照射可引起眼睛的晶狀混濁、睪丸損傷和神經(jīng)功能紊亂等全身性反應(yīng)，因此必須關(guān)好門后才開始操作。

（二)電磁波與射線

1．日光與紫與外

日光是有效的天然殺菌法，對大多數(shù)微生物均有損害作用，直射殺菌效果尤佳，其主要的作用因素為紫外線，此外，熱與氧氣起輔助作用。但光線效應(yīng)受很多因素的影響，如煙塵籠罩的空氣、玻璃及有機物等都能減弱日光的殺菌力。

紫外線是一種低能量的電磁輻射，波長范圍為240～280nm,最適的波長為260nm，這與DNA吸收光譜范圍相一致。其殺菌原理是紫外線易被核蛋白吸收，使DNA的同一條螺旋體上相鄰的堿基形成胸腺嘧啶二聚體，從而干攏DNA的復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)菌死亡或變異。紫外線的穿透能力弱，不能通過普通玻璃、塵埃，只能用于消毒物體表面及空氣、手術(shù)室、無菌操作實驗室及燒傷病房，亦可用于不耐熱物品表面消毒。殺菌波長的紫外線對人體皮膚、眼睛均有損傷作用，使用時應(yīng)注意防護。

2．電離輻射

包括高速電子、X線和r線等。具有較高的能量與穿透力，可在常溫下對不耐熱的物品滅菌，故又稱“冷滅菌”。其機理在于產(chǎn)生游離基，破壞DNA。可用于消毒不耐熱的塑料注射器和導(dǎo)管等；亦能用于食品消毒而不破壞其營養(yǎng)成份。

（三)濾過除菌法

將液體或空氣通過含有微細(xì)小孔的濾器，只允許小于孔徑的物體如液體和空氣通過，大于孔徑的的物體不能通過。主要用于一些不耐熱的血清、毒素、抗生素、藥液、空氣等除菌。一般不能除去病毒、支原體和細(xì)菌的L型。濾器的種類很多常用的有：

濾膜濾器（Membrane filter)由硝基纖維素制成薄膜，裝于濾器上，其孔徑大小不一，常用于除菌的為0.22um。硝基纖維素的優(yōu)點是本身不帶電荷，故當(dāng)液體濾過后，其中有效成分喪失較少。

蔡氏濾器（Seitz)是用金屬制成，中間夾石棉濾板，按石棉K、EK、EK-S三種，常用EK號除菌。

玻璃濾器是用玻璃細(xì)砂加熱壓成小碟，嵌于玻璃漏斗中一般為G1、G2、G3、G4、G5、G6六種，G5、G6可阻止細(xì)菌通過。

實驗室等處應(yīng)用的超凈工作臺，就是利用過濾除菌的原理去除進入工作臺空氣中的細(xì)菌。

（四)超聲與超聲波（Ultrasonic and sonic waves)

每秒鐘超過200，000次振動的聲波不被人耳感受，稱為超聲波。微生物對強度高的超聲波很敏感。其中以革蘭氏陰性菌最敏感，而葡萄球抵抗最強。雖然聲波強烈地振動可使菌群死亡，但往往有殘存者。因此，這種方法在消毒滅菌方面無實用價值。主要用以裂解細(xì)胞分離提取細(xì)胞組分或制備抗原。超聲波滅菌的機理尚不清楚，可能是細(xì)菌外表受細(xì)微氣泡的作用，擾亂細(xì)胞內(nèi)容物及破壞細(xì)胞壁致細(xì)菌崩解而死亡。

（五)干燥

多數(shù)細(xì)菌的繁殖體在空氣中干燥時很快死亡，例如腦膜炎雙球菌、淋球菌、霍亂弧菌、梅毒螺旋體等。有些細(xì)菌抗干燥力較強，尤其有蛋白質(zhì)等物質(zhì)保護時。例如溶血性鏈球菌在塵埃中存活25日，結(jié)核桿菌在干痰中數(shù)月不死。芽胞抵抗力更強，例如炭疽桿菌耐干燥20余年。干燥法常用于保存食物。濃鹽或糖漬食品，可使細(xì)菌體內(nèi)水分逸出，造成生理性干燥，使細(xì)菌的生命活動停止。

（六)低溫

多數(shù)細(xì)菌耐低溫。在低溫狀態(tài)下，這些細(xì)菌的代謝減慢，當(dāng)溫度如回升到適宜范圍又能恢復(fù)生長繁殖，故低溫常用作保存菌種。

二、化學(xué)因素

化學(xué)藥物能影響細(xì)菌的化學(xué)組成、物理結(jié)構(gòu)和生理活動，從而發(fā)揮防腐，消毒，甚至滅菌的作用。防腐劑的濃度高或作用時間長，也可達到消毒的目的。消毒及防腐藥物對人體組織有害，只能外用或用于環(huán)境消毒。

（一)化學(xué)消毒劑

1．化學(xué)消毒劑的種類

化學(xué)消毒劑的種類很多，其殺菌作用亦不盡相同。一般可根據(jù)用途與消毒劑的特點選擇使用（見表4-2)

表4-2 消毒劑種類、性質(zhì)與用途

2．化學(xué)消毒劑的作用機制

不同的化學(xué)消毒劑其作用原理也不完全相同，大致歸納為三個方面。一種化學(xué)消毒劑對細(xì)菌的影響常以其中一方面為主，兼有其他方面的作用。

（1)改變細(xì)胞膜通透性 表面活性劑（Surface-active agent)、酚類及醇類可導(dǎo)致胞漿膜結(jié)構(gòu)紊亂并干擾其正常功能。使小分子代謝物質(zhì)溢出胞外，影響細(xì)胞傳遞活性和能量代謝。甚至引起細(xì)胞破裂。

（2)蛋白變性或凝固酸、堿和醇類等有機溶劑可改變蛋白構(gòu)型而攏亂多肽鏈的折疊方式，造成蛋白變性。如乙醇、大多數(shù)重金屬鹽、氧化劑、醛類、染料和酸堿等。

（3)改變蛋白與核酸功能基團的因子作用于細(xì)菌胞內(nèi)酶的功能基（如SH基)而改變或抑制其活性。如某些氧化劑和重金屬鹽類能與細(xì)菌的-SH基結(jié)合并使之失去活性。

3．影響消毒劑作用的因素

（1)消毒劑的性質(zhì)、濃度與作用時間各種消毒劑的理化性質(zhì)不同，對微生物的作用大小也差異。例如表面活性劑對革蘭氏陽性菌的滅菌效果比對革蘭氏陰性菌好，龍膽紫對葡萄球菌的效果特別強。

同一種消毒劑的濃度不同，其消毒效果也不一樣。大多數(shù)消毒劑在高濃度時起殺菌作用，低濃度時則只有抑菌作用。在一定濃度下，消毒劑對某種細(xì)菌的作用時間越長，其效果也越強。若溫度升高，則化學(xué)物質(zhì)的活化分子增多，分子運動速度增加使化學(xué)反應(yīng)加速，消毒所需要的時間可以縮短。

（2)微生物的污染程度微生物污染程度越嚴(yán)重，消毒就越困難，因為微生物彼此重疊，加強了機械保護作用。所以在處理污染嚴(yán)重的物品時，必須加大消毒劑濃度，或延長消毒作用的時間。

（3)微生物的種類和生活狀態(tài)不同的細(xì)菌對消毒劑的抵抗力不同，細(xì)菌芽胞的抵抗力最強，幼齡菌比老齡菌敏感。

（4)環(huán)境因素當(dāng)細(xì)菌和有機物特別是蛋白質(zhì)混在一起時，某些消毒劑的殺菌效果可受到明顯影響。因此在消毒皮膚及器械前應(yīng)先清潔再消毒。

（5)溫度、濕度、酸堿度消毒速度一般隨溫度的升高而加快，所以溫度越高消毒效果越好。濕度對許多氣體消毒劑有影響。酸堿度的變化可影響劑殺滅微生物的作用。例如，季胺鹽類化合物的戊二醛藥物在堿性環(huán)境中殺滅微生物效果較好；酚類和次氯酸鹽藥劑則在酸性條件下殺滅微生物的作用較強。

（6)化學(xué)拮抗物陰離子表面活性劑可降低季胺鹽類和洗比泰的消毒作用，因此不能將新潔爾滅等消毒劑與肥皂、陰離子洗滌劑合用。次氯酸鹽和過氧乙酸會被硫代硫酸鈉中和，金屬離子的存在對消毒m.f1411.cn效果也有一定影響，可降低或增加消毒作用。

（二)防腐劑

用于防腐的藥物稱為防腐劑。生物制劑（如疫苗、類毒素、抗毒素等)中常加入防腐劑，以防止雜菌生長。常用防腐劑有0.5%石炭酸、0.01%硫柳汞和0.1～0.2%甲醛等。

（三)化學(xué)療劑

用于治療由微生物或寄生蟲所引起疾病的化學(xué)藥物，稱為化學(xué)治療劑，化學(xué)治療劑具有選擇性毒性作用，能在體內(nèi)抑制微生物的生長繁殖或使其死亡，對人體細(xì)胞一般毒性較小，可以口服、注射�；瘜W(xué)治療劑的種類很多，常用的有磺胺類、呋喃類和異煙肼等。

三、生物因素的影響

（一)噬菌體（Bacteriophage)

噬菌體是能感染細(xì)菌、放線菌、真菌、螺旋體的病毒。噬菌體分布廣泛，凡是有細(xì)菌存在的場所，就可能有相應(yīng)噬菌體的存在。噬菌體有嚴(yán)格的宿主特異性，只寄居于易感宿主菌體內(nèi)。

在電鏡下噬菌體有三種外形，蝌蚪形、微球形和線形。大多數(shù)噬菌體呈蜊蚪形，由頭部和尾部兩部分組成（圖4-1)。但也有無尾的噬菌體。較大的噬菌體頭部的形狀常為六棱柱體，頭部含有核酸，外圍繞一層蛋白質(zhì)外殼。少數(shù)噬菌體還具有包膜。噬菌體的尾部為噬菌體與細(xì)菌接觸的器官。不同的噬菌體尾部結(jié)構(gòu)差異很大。噬菌體的化學(xué)成份僅含蛋白質(zhì)及一種核酸，大部分噬菌體的核酸是DNA。噬菌體對理化因素的抵抗力較強。

圖4-1 大腸桿菌T2噬菌體結(jié)構(gòu)模式圖

1．噬菌體和宿主菌細(xì)胞的關(guān)系

噬菌體感染細(xì)菌時，先通過尾刺或尾絲等特異地吸附到敏感細(xì)菌表面相應(yīng)受體上，當(dāng)噬菌體的尾插入細(xì)菌體時，借助于尾部含有的一種溶菌酶類物質(zhì)，將胞壁溶一小孔使尾鞘插入，噬菌體的核酸很快從尾部注入細(xì)菌細(xì)胞，而致細(xì)菌發(fā)生感染。細(xì)菌感染后可出現(xiàn)菌體裂解或形成溶源性細(xì)菌兩種結(jié)果（圖4-2)。

圖4-2 噬菌體與細(xì)菌的相互作用（噬菌體-宿主生活周期)示意圖

噬菌體核酸進入細(xì)胞漿后，宿主細(xì)胞即停止合成細(xì)菌自身的DNA，轉(zhuǎn)而按噬菌體DNA所提供的遺傳信息合成新的蛋白質(zhì)，包括一些合成噬菌體DNA所需的酶及噬菌體頭、尾部蛋白質(zhì)亞單位等。當(dāng)噬菌體DNA和蛋白質(zhì)分別合成以后，在細(xì)菌胞漿內(nèi)裝配成為完整的成熟噬菌全。當(dāng)它們增殖到一定程度，菌細(xì)胞發(fā)生裂解，釋放出游離的噬菌體。噬菌體進入細(xì)菌細(xì)胞后，能在敏感宿主菌內(nèi)復(fù)制增殖并使之裂解的噬菌體稱為毒性噬菌體（Virulent phage)。

有些噬菌體不在敏感細(xì)菌內(nèi)增殖，其基因整合于細(xì)菌基因組中，成為細(xì)菌DNA的一部分，當(dāng)細(xì)菌分裂時，噬菌體的基因亦隨著分布至兩個子代細(xì)菌的基因中。這種噬菌體稱為溶源性噬菌體（Lysogenic phage)或溫和噬菌體(Temperat phage)。整合在細(xì)菌DNA上的噬菌體基因稱為前噬菌體(Prophage)，帶有前噬菌體的細(xì)菌稱為溶源性細(xì)菌(Lysogeneic bacteria)。

溶源性噬菌體能正常繁殖，但這種帶噬菌體的溶源狀態(tài)有時能自發(fā)終止，結(jié)果導(dǎo)致噬菌體增殖而引起細(xì)菌裂解。用紫外線照射或過氧化氫等處理溶源性細(xì)菌，可誘導(dǎo)前噬菌體從細(xì)菌的DNA分開，而開始其溶菌性周期。偶爾溶源性細(xì)菌也可失去前噬菌體。

2．噬菌體在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的應(yīng)用

（1)細(xì)菌的鑒定與分型噬菌體的作用具有高度特異性。一種噬菌體只能裂解一種或與該種相近的細(xì)菌，故可用于細(xì)菌的鑒定和分型。目前已利用噬菌體將金黃色葡萄球菌分為四個群數(shù)百個型，這種用噬菌體分型的方法，在流行病學(xué)調(diào)查上，對追查和分析這些細(xì)菌性感染的傳染源很有幫助。

（2)檢測標(biāo)本中的細(xì)菌應(yīng)用噬菌體效價增長試驗檢查標(biāo)本中的相應(yīng)細(xì)菌，若在檢材中檢出某種噬菌體時，常提示有相應(yīng)細(xì)菌存在。

（3)分子生物學(xué)研究的重要工具噬菌體基因數(shù)量少，有些噬菌體為某種遺傳基因缺陷株，有些噬菌體經(jīng)人工誘導(dǎo)的變異和遺傳容易控制和辯認(rèn)，并且可用于基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)和變換等研究。近年來，噬菌體已成為遺傳研究中的主要的基因載體工具。

（二)抗生素（Antibiotic)

某些微生物在代謝過程中產(chǎn)生的，能抑制或殺滅其他微生物的一種化學(xué)物質(zhì)�？股�素主要來源于放線菌、某些真菌和細(xì)菌。目前生產(chǎn)的抗生素，除從微生物培養(yǎng)液中提取外，有些已能人工合成或半合成。

抗生素的作用主要干擾病原微生物的代謝過程，從而起到抑菌或殺菌作用。抗生素的作用原理大體可概括以下方式：（1)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成（如青霉素)；（2)影響細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性（如多粘菌素)；（3)抑制菌體蛋白質(zhì)的合成（如氯霉素、四環(huán)素)；（4)抑制細(xì)菌核酸合成（如灰黃霉素)。

（三)細(xì)菌素（Bacteriocin)

是某些細(xì)菌產(chǎn)生的一類抗菌物質(zhì)，作用譜窄，因而治療應(yīng)用價值不大。目前認(rèn)為有一定應(yīng)用價值的，只是在細(xì)菌的分型及流行病學(xué)的調(diào)查上。