公開(kāi)(公告)號(hào)
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CN100336912C
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公開(kāi)(公告)日
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2007.09.12
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN200510012425.5
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申請(qǐng)日期
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2005.03.25
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專利名稱
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利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽-rhANP的方法
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主分類號(hào)
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C12P21/02(2006.01)I
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分類號(hào)
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C12P21/02(2006.01)I;C12R1/19(2006.01)I
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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深圳國(guó)家生化工程技術(shù)開(kāi)發(fā)中心
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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林 楓;于志江;王玉樹;周兆平;章 剛;陳 旭;梁四五;姚小建;駱曉棟;歐陽(yáng)藩
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地址
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518057廣東省深圳市深南大道市高新技術(shù)工業(yè)村W2-A2
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頒證日
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國(guó)際申請(qǐng)
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進(jìn)入國(guó)家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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深圳市智科友專利商標(biāo)事務(wù)所
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代理人
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曲家彬
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國(guó)省代碼
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廣東;44
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主權(quán)項(xiàng)
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利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽-rhANP的方法,其特征在于該方法包括如下工藝步驟:A、將斜面菌種經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)制成種子液;所述的將斜面菌種經(jīng)二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)制備成種子液,其中第一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:胰蛋白胨6-15g/L,酵母粉3-8g/L,氯化鈉4-6g/L,氨芐青霉素50-200mg/L;接種量1-2%,培養(yǎng)溫度為28-32℃,培養(yǎng)周期為6-10小時(shí);第二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)中培養(yǎng)基選用甘油培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基由下列成份組成:胰蛋白胨12-18g/L,酵母粉8-15g/L,氯化鈉5g/L,甘油5-10g/L;接種量1-2%,培養(yǎng)溫度28-32℃,培養(yǎng)周期12-18小時(shí);B、將A步驟中制備的種子液按種子液:發(fā)酵培養(yǎng)基按2-5%的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,其中發(fā)酵培養(yǎng)基包括下列體積重量份的組分:甘油3-8g/L,胰蛋白胨4-10g/L,酵母粉2-6g/L,KH2PO44-10g/L,K2HPO46-12g/L,(NH4)2SO41-4g/L,MgCl20.5-2g/L,微量元素1ml/L;培養(yǎng)溫度為28-32℃,培養(yǎng)15-20小時(shí)后誘導(dǎo),誘導(dǎo)溫度為41-43℃,誘導(dǎo)時(shí)間4-6小時(shí);升溫誘導(dǎo)之前,將菌體的平均比生長(zhǎng)速率控制在0.2~0.4;所述的微量元素由下列成份組成:FeSO4·7H2O1-3g/L,CoCl2·6H2O2-4g/L,MnCl2·4H2O1-3g/L,CuSO43-8g/L,ZnSO41-4g/L,EDTA2-5g/L,H3BO33-6g/L,Na2MoO4·2H2O1.5-5g/L;發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌增殖階段的pH值控制在6.9-7.1,在目的基因表達(dá)階段的pH值為7.1-7.3,通氣量為0.5~1.5VVM,發(fā)酵過(guò)程的溶解氧濃度為15%-50%,并進(jìn)行補(bǔ)料,控制補(bǔ)料速率與菌體的消耗速率相當(dāng),使發(fā)酵液中的甘油濃度維持在1.0~3.0g/L;發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體,離心條件為3500-5000rpm,4-10℃,15-20分鐘,發(fā)酵周期為19-26小時(shí);所述的補(bǔ)料方式為對(duì)數(shù)流加方式,補(bǔ)料培養(yǎng)基由下列成份組成:甘油100-500g/L,酵母粉20-60g/L,胰蛋白胨20-50g/L,(NH4)2SO410-50g/L,MgSO48-20g/L;C、純化(1)包涵體的提。簩步驟中收集的菌體按1∶5-10的比例用緩沖液重懸,緩沖液組成為150-250mMNaCl,10-50mMTris-HCl,1mMEDTA-Na2,PH7.5-9.0,冰水浴,用均質(zhì)機(jī)以600-700bar壓力勻漿,離心,收集包涵體沉淀;用緩沖液洗滌包涵體1-2次,該緩沖液組成為2M尿素,150-250mMNaCl,10-50mMTris-HCl,1mMEDTA-Na2,PH7.5-9.0,使其SDS-PAGE純度達(dá)到60%以上;將包涵體按1∶20-40的比例加入裂解液,室溫?cái)嚢?-8小時(shí),離心,離心條件為8000-11000rpm,4-25℃,15-30分鐘,棄沉淀,取上清;所述的裂解液為8M尿素,50mMTris,PH8.3;(2)融合蛋白提。河肧epharose6FF疏水層析提取融合蛋白,將(1)步驟中的上清液直接上樣或用2.2M(NH4)2SO4,10-50mMTris-HCl,PH8.0-9.0稀釋一倍后上樣,以2M尿素,0.4M(NH4)2SO4,10-50mMTris-HCl,PH8.0-9.0洗脫,280nm紫外檢測(cè),收集目標(biāo)峰中的第一峰;(3)rhANP初步純化:將步驟(2)中的疏水層析收集物用緩沖液稀釋,該緩沖液組成為10-50mMTris-HCl,150-250mMNaCl,PH8.0-9.0,按每毫克融合蛋白用1-5單位凝血酶的用量加入凝血酶,于28-35℃反應(yīng)4-10小時(shí);以0.1M乙酸-乙酸胺,150-250mMNaCl,0-25%乙腈為流動(dòng)相,用Superdex30pg分離,收集目標(biāo)峰;(4)rhANP精細(xì)純化:采用高效液相色譜柱,流動(dòng)相A為6%乙腈,0.05%-0.1%TFA,流動(dòng)相B為30%乙腈,0.05%-0.1%TFA,進(jìn)行洗脫;收集目標(biāo)峰,去除乙腈和TFA,即為純化的rhANP;發(fā)酵菌種選用大腸桿菌遺傳工程菌株——pCW112-ANP/DH5α。
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摘要
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本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域,特別是利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽-rhANP的方法。本發(fā)明利用大腸桿菌遺傳工程菌株——pCW112-ANP/DH5α經(jīng)過(guò)斜面菌種、擴(kuò)大培養(yǎng)制備種子液、高密度發(fā)酵、分離純化等工藝步驟制備純化的重組人心鈉肽-rhANP。本發(fā)明解決了ANP的表達(dá)和純化比較困難,因而限制了ANP的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的問(wèn)題,具有成本低、原料與菌種易得、操作簡(jiǎn)單,且生產(chǎn)條件易于控制、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),所制備的產(chǎn)物可有效的適于制藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
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國(guó)際公布
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