醫(yī)學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)-附錄:寄生蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)

寄生蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)

第一節(jié)  病原學(xué)診斷技術(shù)

一、糞便檢查

  糞便檢查是診斷寄生蟲(chóng)病的基本方法。為了取得準(zhǔn)確的結(jié)果，送檢標(biāo)本需保持新鮮，保存時(shí)間一般不宜超過(guò)24小時(shí)。如檢查腸內(nèi)原蟲(chóng)滋養(yǎng)體，最好立即檢查，或暫時(shí)保存在35～37oC條件下待查。盛糞便的容器要干凈，糞便中不可混入尿液和其他污染物，以免影響檢查結(jié)果。具體方法如下：

（一).直接涂片法（direct smear method)  

用以檢查蠕蟲(chóng)卵、原蟲(chóng)的包囊和滋養(yǎng)體。方法簡(jiǎn)便，連續(xù)作3次涂片，可以提高檢出率。

^1．  蠕蟲(chóng)卵檢查 滴一滴生理鹽水于潔凈的載玻片上，用牙簽挑取綠豆大小的糞便塊，在生理鹽水中涂抹均勻；涂片的厚度以透過(guò)玻片約可辨認(rèn)書(shū)上的字跡為宜。一般在低倍鏡下檢查，如用高倍鏡觀察，需加蓋片。應(yīng)注意蟲(chóng)卵與糞便中異物的鑒別。蟲(chóng)卵都具有一定形狀和大小，卵殼表面光滑整齊，具固有的色澤，卵內(nèi)含卵細(xì)胞或幼蟲(chóng)。

^2. 原蟲(chóng)檢查

（1)滋養(yǎng)體檢查：涂片應(yīng)較薄，方法同查蠕蟲(chóng)卵。氣溫愈接近體溫，滋養(yǎng)體的活動(dòng)愈明顯。必要時(shí)可用保溫臺(tái)保持溫度。

（2)包囊的碘液染色檢查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代替生理鹽水，糞便涂抹方法同上。若同時(shí)需檢查活滋養(yǎng)體，可在玻片另一側(cè)滴一滴生理鹽水。同上法涂抹糞便標(biāo)本，再蓋上蓋片。片中滴碘液的一側(cè)查包囊；另一側(cè)查活滋養(yǎng)體。

碘液配方：碘化鉀4g，碘2g，蒸餾水100ml。

（3)隱孢子蟲(chóng)卵囊染色檢查：目前最佳的方法為金胺－酚改良抗酸染色法。其次為金胺－酚染色法和改良抗酸染色法。對(duì)于新鮮糞便或經(jīng)10%福爾馬林固定保存（4oC 1個(gè)月內(nèi))的含卵囊糞便都可用這三種方法染色。染色過(guò)程是先用金胺－酚染色，再用改良抗酸染色法復(fù)染。方法步驟如下：

金胺－酚（aura rpme-phenol)染色法：

^① 染液配制：1g/L金胺—酚染色液（第一液)：金胺0.1g，石炭酸5.0g，

蒸餾水100ml；3%鹽酸酒精（第二液)：鹽酸3ml，95%酒精100ml；5g/l高錳酸鉀液（第三液)：高錳酸鉀0.5g，蒸餾水100ml。

^② 染色步驟：滴加第一液于晾干的糞膜上，10～15分鐘后水洗；滴加第

二液，1分鐘后水洗；滴加第三液，1分鐘后水洗，待干；置熒光顯微鏡下檢查。

低倍熒光鏡下，可見(jiàn)卵囊為一圓形小亮點(diǎn)，發(fā)出乳白色熒光。高倍鏡下卵囊呈乳白或略帶綠色，卵囊壁為一薄層，多數(shù)卵囊周圍深染，中央淡染，呈環(huán)狀，核深染結(jié)構(gòu)偏位，有些卵囊全部為深染。但有些標(biāo)本可出現(xiàn)非特異性熒光顆粒，應(yīng)注意鑒別。

改良抗酸（modified acid-fast)染色法：

^① 染色液配制：石炭酸復(fù)紅染色液（第一液)： 堿性復(fù)紅4g，95%酒精

20ml，石炭酸8ml，蒸餾水100ml；10%硫酸溶液（第二液)：純硫酸10ml，蒸餾水90ml（邊攪拌邊將硫酸徐徐傾入水中)；20g/L孔雀綠液（第三液)：20g/L孔雀綠原液1ml，蒸餾水10ml。

^② 染色步驟：滴加第一液于晾干的糞膜上，1.5～10分鐘后水洗；滴加

第二液，1～10 分鐘后水洗；滴加第三液，1分鐘后水洗，待干；置顯微鏡下觀察。

染色后，卵囊呈玫瑰紅色，圓形或橢圓形，背景為綠色。如染色（1.5分鐘)和脫色（2分鐘)時(shí)間短，卵囊內(nèi)子孢子邊界不明顯；如染色時(shí)間長(zhǎng)（5～10分鐘)脫色時(shí)間需相應(yīng)延長(zhǎng)，子孢子邊界明顯。卵囊內(nèi)子孢子均染為玫瑰紅色，子孢子呈月牙形，共4個(gè)。其他非特異顆粒則染成藍(lán)黑色，容易與卵囊區(qū)分。

不具備熒光顯微鏡的實(shí)驗(yàn)室，亦可用本方法先染色，然后在光鏡下過(guò)篩檢查。如發(fā)現(xiàn)小紅點(diǎn)再用油鏡觀察以提高檢出速度和準(zhǔn)確性。

金胺－酚染色－改良抗酸復(fù)染法：本法可克服上述染色法的缺點(diǎn)。具體方

法是：先用金胺酚染色后，再用改良抗酸染色法復(fù)染。光學(xué)顯微鏡下觀察，卵囊同抗酸染色法所見(jiàn)，但非特異性顆粒被染成蘭黑色，兩者顏色截然不同，極易鑒別，使檢出率和準(zhǔn)確性大大提高。

（二)厚涂片透明法（改良加藤法)（modified Kato’s thick smear)  取約50mg（已用100目不銹鋼篩除去糞渣)糞便，置于載玻片上，覆以浸透甘油—孔雀綠溶液的玻璃紙片，輕壓，使糞便鋪開(kāi)（20×25mm)。置于30～36oC溫箱中約半小時(shí)或25oC約1小時(shí)。待糞膜稍干，即可鏡檢。

玻璃紙準(zhǔn)備：將玻璃紙剪成22×30mm大小的小片，浸于甘油—孔雀綠溶液（含純甘油100ml、水100ml和1ml 3%孔雀綠水溶液)中至少浸泡24小時(shí)，至玻璃紙呈現(xiàn)綠色。

使用此法需掌握糞膜的合適厚度和透明的時(shí)間，如糞膜厚且透明時(shí)間短，蟲(chóng)卵難以發(fā)現(xiàn)；如透明時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則蟲(chóng)卵變形，不易辨認(rèn)。

（三)濃聚法（concentration method)

1.沉淀法（sedimentation method)   原蟲(chóng)包囊和蠕蟲(chóng)卵的比重大可沉積于水底，有助于提高檢出率。但比重較小的鉤蟲(chóng)卵和某些原蟲(chóng)包囊則效果較差。

（1)重力沉淀法：即自然沉淀法。本法主要用于蠕蟲(chóng)卵檢查，蠕蟲(chóng)卵比重大于水，可沉于水底，使蟲(chóng)卵濃集。經(jīng)水洗后，視野清晰，易于檢查。

取糞便20～30g、加水制成混懸液，用金屬篩（40～60孔)或2～3層濕紗布過(guò)濾，再加清水沖洗殘?jiān)�；過(guò)濾后的糞液在容器中靜置25分鐘，到去上層液，重新加滿清水，以后每隔15～20分鐘換水一次（共3～4次)，直至上層液清晰為止。最后倒去上層液，取沉渣作涂片鏡檢。如檢查包囊，換水間隔時(shí)間宜延長(zhǎng)至約6小時(shí)（圖1 )。

（2)離心沉淀法（centrifuge sedimentation)：將上述濾去粗渣的糞液離心（1500-2000 rpm)1～2分鐘，倒去上層液，注入清水，再離心沉淀，如此反復(fù)沉淀3～4次，直至上層液澄清為止，最后倒去上層液，取沉渣鏡檢。本法省時(shí)、省力，適用于臨床檢驗(yàn)。

（3)汞碘醛離心沉淀法（merthiolate-iodine-formaldehyde centrifugation sedimentation method, MIFC)：本法既可濃集，又可固定和染色，適用于原蟲(chóng)包囊、滋養(yǎng)體及蠕蟲(chóng)卵和幼蟲(chóng)的檢查。如準(zhǔn)確稱取1g糞便，即可作蠕蟲(chóng)卵的定量檢查。

取糞便1g，加適量（約10ml)汞碘醛液，充分調(diào)勻，用2層脫脂紗布過(guò)濾，再加入乙醚4ml，搖2分鐘，離心（2000 rpm)1～2分鐘，即分成乙醚、糞渣、汞碘醛及沉淀物4層。吸棄上面3層，取沉渣鏡檢。

  汞碘醛配制：

^① 汞醛（MF)液：1/1000硫柳汞酊200ml，甲醛（40%)25ml，甘油50ml，

蒸餾水200ml。

  ② 盧戈氏液：碘5g，碘化鉀10g，蒸餾水100ml。

檢查時(shí)取汞醛液2.35ml及5%盧戈氏液0.15ml混合備用。但混合液保存8小時(shí)后即變質(zhì)，不宜再用；碘液亦不宜于1周后再用。

（4)醛醚沉淀法（formalin-ether sedimentation)：取糞便1～2g置于小容器內(nèi)，加水10～20ml調(diào)勻，將糞便混懸液經(jīng)2層紗布（或100目金屬篩網(wǎng))過(guò)濾，離心（200 rpm)2分鐘；倒去上層糞液，保留沉渣，加水10ml混勻，離心2分鐘；倒去上層液，加10%甲醛7ml。5分鐘后加乙醚3ml，塞緊管口并充分搖勻，取下管口塞，離心2分鐘；即可見(jiàn)管內(nèi)自上而下分為4層。取管底沉渣涂片鏡檢。

本法不僅濃集效果好，而且不損傷包囊和蟲(chóng)卵的形態(tài)，易于觀察和鑒定。對(duì)于含脂肪較多的糞便，本法效果優(yōu)于硫酸鋅浮聚法。但對(duì)布氏嗜碘阿米巴包囊、賈第蟲(chóng)包囊及微小膜殼絳蟲(chóng)卵等的檢查效果較差。

2. 浮聚法（flotation method)：利用比重較大的液體，使原蟲(chóng)包囊或蠕蟲(chóng)卵上浮，集中于液體表面。常用的方法有：

（1)飽和鹽水浮聚法（brine flotation)：此法用以檢查鉤蟲(chóng)卵效果最好，也可用于檢查其他線蟲(chóng)卵和微小膜殼絳蟲(chóng)卵。但不適于檢查吸蟲(chóng)卵和原蟲(chóng)包囊。用竹簽取黃豆粒大小的糞便置于浮聚瓶（高3.5cm，直徑約2cm的圓形直筒瓶)中，加入少量飽和鹽水調(diào)勻，再慢慢加入飽和鹽水至液面略高于瓶口，以不溢出為止。此時(shí)在瓶口覆蓋一載玻片，靜置15分鐘后，將載玻片提起并迅速翻轉(zhuǎn)，鏡檢（圖 2)。

飽和鹽水配制：將食鹽徐徐加入盛有沸水的容器內(nèi)，不斷攪動(dòng)，直至食鹽不再溶解為止。

（2)硫酸鋅離心浮聚法（zinc sulfate centrifuge flotation)：此法適用于檢查原蟲(chóng)包囊、球蟲(chóng)卵囊、線蟲(chóng)卵和微小膜殼絳蟲(chóng)卵。取糞便約1g，加10～15倍的水，充分?jǐn)囁�，按離心沉淀法過(guò)濾，反復(fù)離心3～4次，至水清為止，最后倒去上清液，在沉渣中加入比重為1.18的硫酸鋅液（33%的溶液)，調(diào)勻后再加硫酸鋅溶液至距管口約1cm處，離心1分鐘。用金屬環(huán)粘取表面的糞液置于載玻片上，加碘液一滴（查包囊)，鏡檢。取標(biāo)本時(shí)，用金屬環(huán)輕輕接觸液面即可，切勿攪動(dòng)。離心后應(yīng)立即取標(biāo)本鏡檢，若放置時(shí)間超過(guò)1小時(shí)，會(huì)因包囊或蟲(chóng)卵變形而影響觀察效果。

（3)蔗糖溶液離心浮聚法(flotation method with sucrose solution)：此法適用于檢查糞便中隱孢子蟲(chóng)的卵囊。取糞便約5g，加水15～20ml，以260目尼龍袋或4層紗布過(guò)濾。取濾液離心5～10分鐘，吸棄上清液，加蔗糖溶液（蔗糖500g，蒸餾水320ml，石炭酸6.5ml)再離心，然后如同飽和鹽水浮聚法，取其表面液鏡檢（高倍或油鏡)。卵囊透明無(wú)色，囊壁光滑，內(nèi)含一小暗點(diǎn)和呈蛋黃色的子孢子。隱孢子蟲(chóng)的卵囊在漂浮液中浮力較大，常緊貼于蓋片之下，鑒于1小時(shí)后卵囊脫水變形不易辨認(rèn)，故應(yīng)立即鏡檢。也可用飽和硫酸鋅溶液或飽和鹽水替代蔗糖容液。

常見(jiàn)蠕蟲(chóng)卵、原蟲(chóng)包囊的比重見(jiàn)表1。

表1   蠕蟲(chóng)卵、原蟲(chóng)包囊的比重

(四)毛蚴孵化法（miracidium hatching method)  依據(jù)血吸蟲(chóng)卵內(nèi)的毛蚴在適宜溫度的清水中，短時(shí)間內(nèi)可孵出的特性而設(shè)計(jì)的方法。取糞便約30g，先經(jīng)重力沉淀法濃集處理，再將糞便沉渣倒入三角燒瓶?jī)?nèi)，加清水（城市中須用去氯自來(lái)水)至瓶口，在20～30oC的條件下，經(jīng)4～6小時(shí)后用肉眼或放大鏡觀察結(jié)果。如見(jiàn)水面下有白色點(diǎn)狀物作直線來(lái)往游動(dòng)，即是毛蚴。必要時(shí)也可以用吸管將毛蚴吸出鏡檢。如無(wú)毛蚴，每隔4～6小時(shí)（24小時(shí)內(nèi))觀察一次。氣溫高時(shí)，毛蚴可在短時(shí)間內(nèi)孵出，因此在夏季要用1.2％食鹽水或冰水沖洗糞便，最后一次才改用室溫清水。

毛蚴促孵法：將用沉淀法處理后的糞便沉渣置于三角瓶?jī)?nèi)，不加水，或?qū)⒓S便置于吸水紙上，再放在20～30oC溫箱中過(guò)夜。檢查前再加清水，2小時(shí)后就可見(jiàn)到孵出的毛蚴。采用此法，毛蚴孵出時(shí)間較一致，數(shù)量也較多。

(五) 肛門拭子法（anal swab)　適用于檢查肛周產(chǎn)卵的蟯蟲(chóng)或�？稍诟亻T附近發(fā)現(xiàn)的帶絳蟲(chóng)卵。

1.棉簽拭子法  先將棉簽浸泡在生理鹽水中，取出時(shí)擠去過(guò)多的鹽水，在肛門周圍搽拭，隨后將棉簽放入盛有飽和鹽水的試管中，用力攪動(dòng)，迅速提起棉簽，在試管內(nèi)壁擠干水分后棄去，再加飽和鹽水至管口處，覆蓋一截玻片，務(wù)使其接觸液面，5分鐘后取下載玻片鏡檢。也可將擦拭肛門的棉簽放在盛清水的試管中，經(jīng)充分浸泡，取出，在試管內(nèi)壁擠去水分后棄去。試管靜置10分鐘，或經(jīng)離心后倒去上層液，取沉渣鏡檢。

2.透明膠紙法（cellophane tape)  用長(zhǎng)約6cm，寬約2cm的透明膠紙有膠面，粘貼肛門周圍的皮膚，然后將有膠的一面平貼在玻片上，鏡檢。

(六) 鉤蚴培養(yǎng)法（culturmethod for hookworm larvae)  根據(jù)鉤蟲(chóng)卵內(nèi)幼蟲(chóng)在適宜條件下可在短時(shí)間內(nèi)孵出的原理而設(shè)計(jì)的方法。加冷開(kāi)水約1ml于潔凈試管內(nèi)（1×10cm)，將濾紙剪成與試管等寬但較試管稍長(zhǎng)的Ｔ字型紙條，用鉛筆書(shū)寫(xiě)受檢者姓名或編號(hào)于橫條部分。取糞便約0.2～0.4g，均勻涂抹在紙條豎部的上2/3處，再將紙條插入試管，下端浸泡在水中，以糞便不接觸水面為度。在20～30oC條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每天沿管壁補(bǔ)充冷開(kāi)水，以保持水面高度。3天后用肉眼或放大鏡檢查試管底部。鉤蚴在水中常作蛇行游動(dòng)，蟲(chóng)體透明。如未發(fā)現(xiàn)鉤蚴，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)觀察至第5天。氣溫太低時(shí)可將培養(yǎng)管放入溫水（30oC左右)中數(shù)分鐘后，再行檢查。

 此法亦可用于分離人體腸道內(nèi)各種阿米巴滋養(yǎng)體及人毛滴蟲(chóng)滋養(yǎng)體，且能提高檢出率。但每管糞便量應(yīng)為1.0g，適宜溫度為25～30oC，培養(yǎng)時(shí)間為2～4天。臨床上為了及時(shí)報(bào)告致病原蟲(chóng)，可于培養(yǎng)48小時(shí)后鏡檢。

(七)蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)法（egg count)　蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)可用于估計(jì)人體內(nèi)寄生蟲(chóng)的感染度，

常用司徒爾（Stoll)氏法，即司氏稀釋蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)法（圖4 )。

 用特制的三角燒瓶（或普通三角燒瓶)，容量為65ml左右，在燒瓶的頸部相當(dāng)于56和60ml處，有兩個(gè)刻度。先把0.1ml/L NaOH溶液到入瓶?jī)?nèi)至56ml處，再慢慢地加入糞便，到液面上升到60ml處，然后放進(jìn)玻璃珠10余顆，用橡膠塞塞緊瓶口，充分搖動(dòng)，使其成為十分均勻的混懸液。

計(jì)數(shù)時(shí)充分搖勻，用有刻度的小吸管吸取0.075或0.15ml糞液置于載玻片上，加蓋片，在低倍鏡下計(jì)數(shù)全片的蟲(chóng)卵數(shù)，乘以200（取樣0.075ml)或100（取樣0.15ml)即得每克糞便蟲(chóng)卵數(shù)。由于糞便的性狀對(duì)估算結(jié)果有明顯的影響，因此不成形糞便中的蟲(chóng)卵數(shù)應(yīng)再乘糞便性狀系數(shù)，即半成形糞便×1.5，軟濕形糞便×2，粥狀糞便×3，水瀉糞便×4。

  每克糞便含卵數(shù)×24小時(shí)糞便克數(shù)

  雌蟲(chóng)數(shù)=————————————————————

   已知雌蟲(chóng)數(shù)每天排卵總數(shù)

成蟲(chóng)總數(shù)=雌蟲(chóng)總數(shù)×2。

(八) 定量透明法  適用于各種糞便內(nèi)蠕蟲(chóng)卵的檢查及計(jì)數(shù)。此法系應(yīng)用改良聚苯乙烯作定量板（圖附錄-5)，大小為40×30×1.37mm，�？诪橐婚L(zhǎng)圓孔，大小為8×4mm，兩端呈半圓形，所取的糞樣平均為41.7mg。操作時(shí)將大小約4×4cm的100目尼龍網(wǎng)或金屬篩網(wǎng)覆蓋在糞便標(biāo)本上，自篩網(wǎng)上用刮片刮取糞便，置定量板與載玻片上，用兩指壓住定量板的兩端，將刮片上的糞便填滿模孔，刮去多余糞便。掀起定量板，載玻片上留下一長(zhǎng)形糞條，然后在糞條上覆蓋含甘油—孔雀綠溶液的玻璃紙條，展平后加壓，使玻璃紙下的糞便鋪成長(zhǎng)橢圓形。經(jīng)1～2小時(shí)透明后置鏡下計(jì)數(shù)。將所得蟲(chóng)卵數(shù)×24，再乘上述糞便性狀系數(shù)，即為每克糞便蟲(chóng)卵數(shù)（eggs per gram， EPG)。

(九) 淘蟲(chóng)檢查法  為了考核驅(qū)蟲(chóng)效果，常需從糞便中淘取驅(qū)除的蟲(chóng)體進(jìn)行鑒定與計(jì)數(shù)。取患者服藥后24～72小時(shí)的全部糞便，加水?dāng)嚢瑁�用篩（40目)或紗布濾出糞渣，經(jīng)水反復(fù)沖洗后，倒在盛有清水的大型玻皿內(nèi)。檢查混雜在糞渣中的蟲(chóng)體時(shí)，應(yīng)在玻皿下襯以黑紙。

(十) 帶絳蟲(chóng)孕節(jié)檢查法  絳蟲(chóng)節(jié)片用清水洗凈，置于兩張玻片之間，輕輕壓平，對(duì)光觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并根據(jù)子宮分支情況鑒定蟲(chóng)種。也可用注射器從孕節(jié)后端正中部插入子宮內(nèi)徐徐注射炭素墨水或卡紅，待子宮分支顯現(xiàn)后計(jì)數(shù)。

卡紅染液配制：鉀明礬飽和液100ml，卡紅3g，冰醋酸10m.f1411.cn/pharm/ml�；旌鸵褐糜�37oC溫箱內(nèi)過(guò)夜，過(guò)濾后即可應(yīng)用。

表附錄-2  各種蠕蟲(chóng)每條雌蟲(chóng)每日排卵數(shù)

 二、血液檢查

血液檢查是診斷瘧疾、絲蟲(chóng)病的基本方法。涂制血膜用的載玻片用前需經(jīng)洗滌液處理，再用自來(lái)水或蒸餾水沖洗，在95%酒精中浸泡，擦干或烤干后使用。采血針用前必須消毒或用一次性針頭，一人一針以免交叉感染。

洗滌液配制：常用玻璃器皿的洗滌液為鉻酸洗液，含工業(yè)濃硫酸100ml、重鉻酸鉀80g、水1000ml。先用冷水將重鉻酸鉀溶化，然后徐徐加入濃硫酸，同時(shí)用玻璃棒攪拌。

（一)檢查瘧原蟲(chóng)　

1. 采血與涂片   用75%酒精棉球消毒耳垂，待干后用左手拇指與食指捏著耳垂下方，并使耳垂下側(cè)方皮膚崩緊，右手持取血針、刺破皮膚，擠出血滴。薄、厚血膜可涂制在同一張玻片上（圖6 )。間日瘧原蟲(chóng)宜在發(fā)作后數(shù)小時(shí)采血；惡性瘧在發(fā)作初期采血可見(jiàn)大量環(huán)狀體，1周后可見(jiàn)配子體。

(1) 薄血膜的制作：在載玻片1/3與2/3交界處蘸血一小滴，以一端緣光滑的載片為推片，將推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端緣擴(kuò)散后，自右向左推成薄血膜。操作時(shí)兩載片間的角度為30~45°，推動(dòng)速度應(yīng)適宜，不宜太快或太慢。理想的薄血膜，應(yīng)是一層均勻分布的血細(xì)胞，血細(xì)胞間無(wú)空隙且血膜末端呈掃帚狀。

(2) 厚血膜的制作：于載玻片的另一端1/3處蘸血一小滴（約10mm3)，以推片的一角，將血滴自內(nèi)向外作螺旋形攤開(kāi)，使之成為直徑約0.8—1cm，厚薄均勻的厚血膜。厚血膜為多層血細(xì)胞的重疊，約等于20倍薄血膜的厚度

2. 固定與染色   血片必須充分涼干否則染色時(shí)容易脫落。用小玻棒蘸甲醇或無(wú)水酒精在薄血膜上輕輕抹過(guò)以固定血膜。如薄、厚血膜在同一玻片上，切勿將固定液帶到厚血膜上，因厚血膜固定之前必須進(jìn)行溶血�？捎玫喂艿嗡�于厚血膜上，待血膜呈灰白色時(shí)，將水到去，涼干。在稀釋各種染液和沖洗血膜時(shí)，如用緩沖液則染色效果更佳。緩沖液的配置如下：

磷酸氫二鈉液：無(wú)水磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄)9.64g，蒸餾水1000ml。

   M/15磷酸二氫鉀液：磷酸二氫鉀（KH₂PO₄)9.073g，蒸餾水1000ml。使用時(shí)將上述原液按下表配制成不同的pH緩沖液：

表3   緩沖液配制

  染色時(shí)臨時(shí)配制成pH 7.0或7.2的緩沖液。

  常用的染色劑有姬氏染劑（Giemsa"s  stain)和瑞氏染劑（Wright"s  stain)。

⁽¹⁾  姬氏染色法：此法染色效果良好，血膜褪色較慢，保存時(shí)間較久，但染色時(shí)間較長(zhǎng)。

① 染液配置：姬氏染劑粉1g，甲醇50ml，純甘油50ml 。將姬氏染劑粉

置于研缽中（最好用瑪瑙研缽)，加小量甘油充分研磨，加甘油再磨，直至50ml甘油加完為止，倒入棕色玻瓶中。然后分幾次用少量甲醇沖洗缽中的甘油染粉，倒入玻瓶直至50ml甲醇用完為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置65oC溫箱內(nèi)24小時(shí)或室溫內(nèi)一周后過(guò)濾，備用。

染色方法：用pH 7.0～7.2的緩沖液，將姬氏染液稀釋；比例約為15～20份緩沖液加一份姬氏染液。用蠟筆劃出染色范圍，將稀釋的姬氏染液滴于已固定的薄、厚血膜上，染色半小時(shí)（室溫)，再用上述緩沖液沖洗。血片涼干后鏡檢。

(2) 快速姬氏染色法：姬氏染液1ml，加緩沖液5ml，如前法染色5分鐘后用緩沖液沖洗，涼干后鏡檢。

(3) 瑞氏染色法：此法操作簡(jiǎn)便，適用于臨床診斷，但甲醇蒸發(fā)甚快，掌握不當(dāng)易在血片上留下染液沉渣，并較易褪色，保存時(shí)間不長(zhǎng)，故多用于臨時(shí)性檢驗(yàn)。

① 染液配制：瑞氏染劑粉0.1～0.5g，甲醇97ml，甘油3ml。將瑞氏染劑加入甘油中充分研磨，然后加少量甲醇，研磨后倒入瓶?jī)?nèi)，再分幾次用甲醇沖洗缽中的甘油溶液，倒入瓶?jī)?nèi)，直至用完為止。搖勻，24小時(shí)后過(guò)濾待用。一般1～2周后再過(guò)濾。

② 染色方法：瑞氏染劑含甲醇，因此制備薄血膜時(shí)不需另行固定，而厚血膜則需先經(jīng)溶血，待血膜干后才能染色。染色前先將薄血膜和溶過(guò)血的厚血膜一起用蠟筆劃好染色范圍，以防滴加染液時(shí)外溢。染液應(yīng)覆蓋全部厚、薄血膜上，30秒至1分鐘后再用滴管加等量的蒸餾水，輕輕搖動(dòng)載玻片，使蒸餾水和染液混合均勻，此時(shí)出現(xiàn)一層燦銅色浮膜（染色)，3～5分鐘后用水緩慢從玻片一端沖洗（注意勿先倒去染液或直接對(duì)血膜沖洗)，涼干后鏡檢。

(二) 檢查微絲蚴

1. 新鮮血片檢查  晚間9時(shí)到次晨2時(shí)取耳垂血1大滴滴于載玻片上，加蓋片，在低倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)蛇形游動(dòng)的幼蟲(chóng)后，做染色檢查，以確定蟲(chóng)種。

2. 厚血膜檢查  厚血膜的制作、溶血、固定與瘧原蟲(chóng)的姬氏液染色法相同。但需取血3滴，也可用 德氏蘇木染色法染色。該染液的配制方法如下：

取蘇木素1g溶于純酒精或95%的酒精10ml中，加飽和硫酸鋁銨（8%～10%)100ml，倒入棕色瓶中，瓶口用兩層紗布扎緊，在陽(yáng)光下氧化2～4周，過(guò)濾，加甘油25ml和甲醇25ml，用時(shí)稀釋10倍左右，將溶血、固定的厚血膜置于德氏蘇木素液內(nèi)10～15分鐘，在1%酸酒精中分色1～2分鐘，蒸餾水洗滌1～5分鐘，至血膜呈藍(lán)色，再用1%伊紅染色0.5～1分鐘，以水洗滌2～5分鐘，涼干后鏡檢。

3. 活微絲蚴濃集法   在離心管內(nèi)加蒸餾水半管，加血液10～12滴，再加生理鹽水混勻，離心（3000 rpm)3分鐘，取沉渣檢查�；蛉§o脈血1ml， 置于盛有0.1ml 3.8%枸櫞酸鈉的試管中，搖勻，加水9ml，俟紅細(xì)胞破裂后，再離心2分鐘，倒去上清液，加水再離心，取沉渣鏡檢。

 三、   排泄物與分泌物的檢查

（一)痰液  痰中可能查見(jiàn)衛(wèi)氏肺吸蟲(chóng)卵、溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體、棘球蚴的原頭蚴、糞類圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)幼蟲(chóng)、塵螨等；卡氏肺孢子蟲(chóng)的包囊也可出現(xiàn)于痰中，但檢出率很低。

1．肺吸蟲(chóng)卵檢查 可先用直接涂片法檢查，如為陰性，改為濃集法集卵，以提高檢出率。

（1)直接涂片法：在潔凈載玻片上先加1—2滴生理鹽水，挑取痰液少許，最好選帶鐵銹色的痰，涂成痰膜，加蓋片鏡檢。如未發(fā)現(xiàn)肺吸蟲(chóng)卵，但見(jiàn)有夏科—雷登結(jié)晶，提示可能是肺吸蟲(chóng)感染，多次涂片檢查為陰性者，可改用濃集法。

（2)濃集法：收集24小時(shí)痰液，置于玻璃杯中，加入等量10% NaOH溶液，用玻棒攪勻后，放入37oC溫箱內(nèi)，數(shù)小時(shí)后痰液消化成稀液狀，再分裝于數(shù)個(gè)離心管內(nèi)，以1500 rpm離心5～10分鐘，棄去上清液，取沉渣涂片檢查。

2．溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體檢查   取新鮮痰液作涂片。天冷時(shí)應(yīng)注意鏡臺(tái)上載玻片保溫。高倍鏡觀察，如為阿米巴滋養(yǎng)體，可見(jiàn)其伸出偽足并作定向運(yùn)動(dòng)。

上述其他蠕蟲(chóng)幼蟲(chóng)及螨類等宜用濃集法檢查。

（二)十二指腸液和膽汁  用十二指腸引流管抽取十二指腸液及膽汁，以直

接涂片法鏡檢；也可以經(jīng)離心濃集后，取沉渣鏡檢。可檢查藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體、華支睪吸蟲(chóng)卵、肝片形吸蟲(chóng)卵和布氏姜片蟲(chóng)卵等。在急性阿米巴肝膿腫患者膽汁中偶可發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)體。

檢查方法：可將十二指腸引流液滴于載玻片上，加蓋片后直接鏡檢。為提高檢出率，常將引流液加生理鹽水稀釋攪拌后，分裝于離心管內(nèi)，以2000 rpm，離心5～10分鐘，吸取沉渣涂片鏡檢。如引流液過(guò)于粘稠，應(yīng)先加10% NaOH消化后再離心。引流中的賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體常附著在粘液小塊上，或蟲(chóng)體聚集成絮片狀物。肝片形吸蟲(chóng)卵與姜片蟲(chóng)卵不易鑒別，但前者可出現(xiàn)于膽汁；而后者只見(jiàn)于十二指腸液中。

（三)尿液  取尿液3～5ml，離心（2000 rpm)3～5分鐘，后取沉渣鏡檢。但乳糜尿需加等量乙醚，用力振蕩，使脂肪溶于乙醚，然后吸去脂肪層，離心，取沉渣鏡檢。尿液中可查見(jiàn)陰道毛滴蟲(chóng)、絲蟲(chóng)微絲蚴、埃及血吸蟲(chóng)卵等。

（四)鞘膜積液  主要檢查班氏微絲蚴。陰囊皮膚經(jīng)碘酒精消毒后，用注射器抽取鞘膜積液作直接涂片檢查，也可以加適量生理鹽水稀釋離心，取沉渣鏡檢。

（五)陰道分泌物  檢查陰道毛滴蟲(chóng)。用消毒棉簽在受檢者陰道后穹窿、子宮頸及陰道壁上取分泌物，然后用生理鹽水涂片鏡檢，可發(fā)現(xiàn)活動(dòng)的蟲(chóng)體。天氣寒冷時(shí)，應(yīng)注意保溫。

四、其他器官組織檢查

（一)骨髓穿刺  主要檢查杜氏利什曼原蟲(chóng)無(wú)鞭毛體。一般常作髂骨穿刺，囑患者側(cè)臥，暴露髂骨部位。視年齡大小，選用17～20號(hào)帶有針芯的干燥無(wú)菌穿刺針，從髂骨前上棘后約1cm處刺入皮下，當(dāng)針尖觸及骨面時(shí)，再慢慢地鉆入骨內(nèi)約0.5～1.0cm，即可拔出針芯，接一2ml干燥注射器，抽取骨髓液。取少許骨髓液作涂片，甲醇固定，同薄血膜染色法染色，油鏡檢查。

（二)淋巴結(jié)穿刺

1．利什曼原蟲(chóng)  檢出率低于骨髓穿刺，但方法簡(jiǎn)便、安全。對(duì)于以往治療過(guò)的患者，因其淋巴結(jié)內(nèi)原蟲(chóng)消失較慢，故仍有一定價(jià)值。穿刺部位一般選腹股溝部，先將局部皮膚消毒，用左手拇指和食指捏住一個(gè)較大的淋巴結(jié)，右手用一干燥無(wú)菌6號(hào)針頭刺入淋巴結(jié)。稍待片刻，拔出針頭，將針頭內(nèi)少量淋巴結(jié)組織液滴于載玻片上，做涂片染色檢查。

2．絲蟲(chóng)成蟲(chóng)  同上法獲取淋巴組織液，染色后鏡檢。

（三)肌肉活檢 

1．旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)  從患者腓腸肌、肱或股二頭肌取米粒大小肌肉一塊，置于載玻片上，加50%甘油一滴，蓋上另一載玻片，均勻壓緊，低倍鏡下觀察。取下的肌肉須立即檢查，否則幼蟲(chóng)會(huì)變得模糊，不易觀察。

2．并殖吸蟲(chóng)、裂頭蚴、豬囊尾蚴  摘取肌肉內(nèi)的結(jié)節(jié)，剝除外層纖維被膜，在2張載玻片間壓平、鏡檢。也可經(jīng)組織固定后作切片染色檢查。

（四)皮膚及皮下組織活檢 

1．囊尾蚴、裂頭蚴、并殖吸蟲(chóng)  參見(jiàn)肌肉檢查。

2．皮膚利什曼原蟲(chóng)  在皮膚上出現(xiàn)丘疹和結(jié)節(jié)等疑似皮膚型黑熱病患者，可選擇皮損較明顯之處，作局部消毒，用干燥滅菌的注射器，刺破皮損處，抽取組織液做涂片；或用消毒的鋒利小剪，從皮損表面剪取一小片皮膚組織，以切面做涂片；也可用無(wú)菌解剖刀切一小口，刮取皮膚組織做涂片。以上涂片均用瑞氏或姬氏染液染色。如涂片未見(jiàn)原蟲(chóng)，可割取小丘疹或結(jié)節(jié)，固定后，作組織切片染色檢查。

3．蠕形螨  參看“蠕形螨”一節(jié)。

4．疥螨  參看“疥螨”一節(jié)。

（五)直腸粘膜活檢 

1．日本血吸蟲(chóng)卵  用直腸鏡觀察后，自可疑病變處鉗取米粒大小的粘膜一塊，用生理鹽水沖洗后，放在兩個(gè)載玻片間，輕輕壓平，鏡檢。各型血吸蟲(chóng)卵鑒別見(jiàn)表4

   表4  粘膜內(nèi)未染色血吸蟲(chóng)卵之鑒別

2. 溶組織阿米巴  用乙狀結(jié)腸鏡觀察潰瘍形狀，自潰瘍邊緣或深層刮取潰瘍組織置于載玻片上，加少量生理鹽水，蓋上蓋片，輕輕壓平，立即鏡檢。也可取出一小塊病變粘膜組織，固定后切片染色鏡檢。

（六)肺組織活檢  檢查卡氏肺孢子蟲(chóng)包囊。取一小塊肺組織作涂片，自然   干燥后甲醇固定，用改良銀染色法進(jìn)行染色。

改良銀染色法染色步驟：

（1)將肺涂片置于5%鉻酸，于20oC氧化15分鐘，氧化后的標(biāo)本以流水沖洗數(shù)秒。

（2)1%亞硫酸氫鈉浸1分鐘,自來(lái)水沖洗后，蒸餾水洗滌3～4次。

（3)放入四胺銀工作液內(nèi),并在60oC孵育約90分鐘，至標(biāo)本轉(zhuǎn)至黃褐色為止。流水、蒸餾水各洗5分鐘。

（4)1%氯化金浸2～5分鐘，蒸餾水洗4～5次。

（5)2％硫代硫酸鈉浸5分鐘，流水至少洗10分鐘。

（6)亮綠復(fù)染45秒。

（7)95%、99%、100%乙醇逐級(jí)脫水。

（8)二甲苯透明3次，樹(shù)膠封片。

染色結(jié)果顯示，卡氏肺孢子蟲(chóng)包囊呈圓形、卵圓形或不規(guī)則的多角形，囊壁為淡褐色或深褐色。紅細(xì)胞為淡黃色，背景呈淡綠色。

^{第二節(jié)}     免疫學(xué)診斷技術(shù)

病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)雖有確診疾病的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)早期和隱性感染，以及晚期和未治愈的患者確常常出現(xiàn)漏診。相反，免疫學(xué)診斷技術(shù)則可作為輔助手段而彌補(bǔ)這方面的不足。隨著抗原純化技術(shù)的進(jìn)步、診斷方法準(zhǔn)確性的提高和標(biāo)準(zhǔn)化的解決，使得免疫學(xué)診斷技術(shù)更加廣泛地用于寄生蟲(chóng)病的臨床診斷、療效考核以及流行病學(xué)調(diào)查。鑒于各種免疫學(xué)診斷技術(shù)，在相應(yīng)的免疫學(xué)書(shū)籍或手冊(cè)中均有全面介紹，故本節(jié)重點(diǎn)介紹與寄生蟲(chóng)病診斷有關(guān)的免疫學(xué)檢查技術(shù) 。

一、一般免疫學(xué)診斷技術(shù)

（一)皮內(nèi)試驗(yàn) （intrader rpmal test,ID)  宿主在寄生蟲(chóng)變應(yīng)原刺激后，體內(nèi)產(chǎn)生親細(xì)胞性抗體（IgE和IgG4)。當(dāng)其與相應(yīng)抗原結(jié)合后，肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放生物活性物質(zhì)，引起注射抗原的局部皮膚出現(xiàn)皮丘及紅暈，以此便可判斷體內(nèi)是否某有種特異性抗體存在。

皮內(nèi)試驗(yàn)用于多種蠕蟲(chóng)病，如血吸蟲(chóng)病、肺吸蟲(chóng)病、姜片吸蟲(chóng)病、囊蟲(chóng)病、棘球蚴病等的輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查。本法簡(jiǎn)單、快速，尤適用于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，但假陽(yáng)性率較高。

（二)免疫擴(kuò)散（immunodiffusion)和免疫電泳（immunoelectrophoresis)

1．免疫擴(kuò)散   于一定條件下，抗原與抗體在瓊脂凝膠中相遇，在二者含量比例合適時(shí)形成肉眼可見(jiàn)的白色沉淀。本法有兩種類型：①單相免疫擴(kuò)散：將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使抗原溶液在凝膠中擴(kuò)散而形成沉淀環(huán)，其大小與抗原量成正比；②雙相免疫擴(kuò)散：將抗原與抗體分別置于凝膠板的相對(duì)位置，二者可自由擴(kuò)散并在中間形成沉淀線。用雙相免疫擴(kuò)散法既可用已知抗原檢測(cè)未知抗體，也可用已知抗體檢測(cè)未知抗原。

2．免疫電泳   是將免疫擴(kuò)散與蛋白質(zhì)凝膠電泳相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)。事先將抗原在凝膠板中電泳，之后在凝膠槽中加入相應(yīng)抗體，抗原和抗體雙相擴(kuò)散后，在比例合適的位置，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的弧形沉淀線。

免疫擴(kuò)散法和免疫電泳法，除可用于某些寄生蟲(chóng)病的免疫診斷外，還可用于寄生蟲(chóng)抗原鑒定和檢測(cè)免疫血清的滴度。

（三)間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（indirect haemagglutination test，IHA)  以紅細(xì)胞作為可溶性抗原的載體并使之致敏。致敏的紅細(xì)胞與特異性抗體結(jié)合而產(chǎn)生凝集，抗原與抗體間的特異性反應(yīng)即由此而顯現(xiàn)。常用的紅細(xì)胞為綿羊或O型人紅細(xì)胞。

IHA操作簡(jiǎn)便，特異性和敏感性均較理想，適宜寄生蟲(chóng)病的輔助診斷和現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。現(xiàn)已用于診斷瘧疾、阿米巴病、弓形蟲(chóng)病、血吸蟲(chóng)病、囊蟲(chóng)病、旋毛蟲(chóng)病、肺吸蟲(chóng)病和肝吸蟲(chóng)病等。

（四)間接熒光抗體試驗(yàn) （indirect fluorescent antibody method，IFA)

本法用熒光素（異硫氰基熒光素)標(biāo)記第二抗體，可以進(jìn)行多種特異性抗原抗體反應(yīng)，即可檢測(cè)抗原又可檢測(cè)抗體。本法具有較高的敏感性、特異性和重現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)，除可用于寄生蟲(chóng)病的快速診斷，流行病學(xué)調(diào)查和疫情監(jiān)測(cè)外，還可用于組織切片中抗原定位以及在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平觀察和鑒定抗原、抗體和免疫復(fù)合物。在診斷方面，已用于瘧疾、絲蟲(chóng)病、血吸蟲(chóng)病、肺吸蟲(chóng)病、華支睪吸蟲(chóng)病、包蟲(chóng)病及弓形蟲(chóng)病。

（五)對(duì)流免疫電流試驗(yàn) (counter-immunoelectrophoresis，CIE)  對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)是以瓊脂或瓊脂糖凝膠為基質(zhì)的一種快速，敏感的電泳技術(shù)。既可用已知抗原檢測(cè)抗體，又可用已知抗體檢測(cè)抗原。反應(yīng)結(jié)果可信度高，適用范圍廣。以本法為基礎(chǔ)改進(jìn)的技術(shù)有酶標(biāo)記抗原對(duì)流免疫電泳（enzyme-linked antigen counterimmunoelectrophoresis,ELACIE )和放射對(duì)流免疫電泳自顯影（radio-immuno-counterelectrophoretic autography，RCIEPA)等技術(shù)。二者克服了電泳技術(shù)本身不夠靈敏的弱點(diǎn)。本法可用于血吸蟲(chóng)病、肺吸蟲(chóng)病、阿米巴病、賈第蟲(chóng)病、錐蟲(chóng)病、棘球蚴病和旋毛蟲(chóng)病等的血清學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

（六)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理是將抗原或抗體與底物（酶)結(jié)合，使其保持免疫反應(yīng)和酶的活性。把標(biāo)記的抗原或抗體與包被于固相載體上的配體結(jié)合，再使之與相應(yīng)的無(wú)色底物作用而顯示顏色，根據(jù)顯色深淺程度目測(cè)或用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值判定結(jié)果。  

本法可用于宿主體液、排泄物和分泌物內(nèi)特異抗體或抗原的檢測(cè)。已用于多種寄生蟲(chóng)感染的診斷和血清流行病學(xué)調(diào)查。

（七)免疫酶染色試驗(yàn) （immunoenzyme staining test，IEST)  免疫酶染色試驗(yàn)以含寄生蟲(chóng)病原的組織切片、印片或培養(yǎng)物涂片為固相抗原，當(dāng)其與待測(cè)標(biāo)本中的特異性抗體結(jié)合后，可再與酶標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)形成酶標(biāo)記免疫復(fù)合物，后者可與酶的相應(yīng)底物作用而出現(xiàn)肉眼或光鏡下可見(jiàn)的呈色反應(yīng)。本法適用于血吸蟲(chóng)病、肺吸蟲(chóng)病、肝吸蟲(chóng)病、絲蟲(chóng)病、囊蟲(chóng)病和弓形蟲(chóng)病等的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。  

（八)免疫印跡試驗(yàn)（immunobloting technique，ELIB)  免疫印跡試驗(yàn)又稱免疫印漬或western blot，是由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)印及固相酶免疫試驗(yàn)三項(xiàng)技術(shù)結(jié)合為一體的一種特殊的分析檢測(cè)技術(shù)。本法具有高度敏感性和特異性，可用于寄生蟲(chóng)抗原分析和寄生蟲(chóng)病的免疫診斷。

二、寄生蟲(chóng)學(xué)特殊免疫學(xué)診斷技術(shù) 

（一)診斷弓形蟲(chóng)感染的染色試驗(yàn)（dye test,DT)  染色試驗(yàn)是診斷弓形蟲(chóng)病的一種經(jīng)典方法，具有高度的特異性和敏感性。

1．原理  當(dāng)將活弓形蟲(chóng)滋養(yǎng)體與正常血清混合，在37^oC孵育1小時(shí)或室溫?cái)?shù)小時(shí)后，大多數(shù)蟲(chóng)體失去原有的新月形特征，而變?yōu)閳A形或橢圓形，此時(shí)若用堿性美藍(lán)染色則胞質(zhì)深染。相反，當(dāng)將蟲(chóng)體與免疫血清和補(bǔ)體（輔助因子)混合時(shí)，則仍保持原有形態(tài)，對(duì)堿性美藍(lán)也不著色。

2.材料和試劑 

（1)輔助因子：取正常人血清，與弓形蟲(chóng)速殖子混合，于37^oC作用1小時(shí)，只有90%以上蟲(chóng)體被美藍(lán)染色，該血清方可使用，分裝后置-20^oC備用；

（2)抗原制備：用弓形蟲(chóng)速殖子經(jīng)腹腔感染小鼠，3日后抽取腹腔液，以生理鹽水離心（3000 rpm × 10 分鐘) 3次，收集純凈蟲(chóng)體，用含補(bǔ)體的血清稀釋后，將蟲(chóng)液調(diào)至約50個(gè)蟲(chóng)體/高倍視野；

（3)堿性美藍(lán)溶液：將美藍(lán)10g，溶于100ml濃度為95%的酒精內(nèi)，制成飽和酒精溶液，過(guò)濾后取 3ml再與10ml臨時(shí)配制的堿性緩沖液 ( pH 11.0)混合;

（4)待檢血清：經(jīng)56^oC、30分鐘滅活，4^oC保存?zhèn)溆茫?/P>

（5) 檢測(cè)：取經(jīng)生理鹽水倍比稀釋的待檢血清，每管0.1ml，加抗原液0.1ml， 置37^oC水浴1小時(shí)，加堿性美藍(lán)溶液0.02ml/管，繼續(xù)水浴15分鐘，自每管取懸液1滴鏡檢。

（6)結(jié)果判斷：鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)弓形蟲(chóng)速殖子，統(tǒng)計(jì)著色和不著色速殖子比例數(shù)。 以50%蟲(chóng)體不著色的血清稀釋度為該份受試血清的最高稀釋度。以血清稀釋度1：8陽(yáng)性者判斷為隱性感染；1：125陽(yáng)性者為活動(dòng)性感染；1：1024及以上陽(yáng)性者為急性感染。

（二) 環(huán)卵沉淀試驗(yàn) （circumoval precipitin test，COPT)

1.原理  本試驗(yàn)是專門用于診斷血吸蟲(chóng)病的免疫學(xué)試驗(yàn)。血吸蟲(chóng)卵內(nèi)毛蚴分泌的抗原物質(zhì)經(jīng)卵殼微孔滲出后與待檢血清內(nèi)的特異抗體結(jié)合，可在蟲(chóng)卵周圍形成鏡下可見(jiàn)的免疫復(fù)合物沉淀，即為陽(yáng)性反應(yīng)。產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)蟲(chóng)卵占全部蟲(chóng)卵的百分率稱環(huán)沉率。

2．試驗(yàn)步驟  用毛筆蘸取熔化的石蠟，在潔凈的載玻片上劃兩條與其長(zhǎng)軸垂直的平行線（間距約20mm)，再劃兩條蠟線使成正方形。在其中滴加待檢血清2～3滴，用細(xì)針挑取適量鮮卵或干卵（約100～150個(gè))，混勻,蓋以 24 mm x 24 mm蓋片，用石蠟密封，37^oC保溫，48h后低倍鏡觀察結(jié)果(必要時(shí)可至72小時(shí))。

3．結(jié)果觀察  典型的陽(yáng)性反應(yīng)為卵殼周圍出現(xiàn)泡狀、指狀、片狀或細(xì)長(zhǎng)

卷曲狀的折光性沉淀物。觀察100個(gè)蟲(chóng)卵，計(jì)算環(huán)沉率。凡環(huán)沉率≥5% 者為陽(yáng)性（在血吸蟲(chóng)病傳播控制或傳播阻斷地區(qū)環(huán)沉率≥3%者可判為陽(yáng)性)，1%～4%者為弱陽(yáng)性。環(huán)沉率的動(dòng)態(tài)變化在治療上具有參考意義。 

三、單克隆抗體在寄生蟲(chóng)病診斷中的應(yīng)用 

單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb)是用經(jīng)特異性抗原刺激的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交、融合后分泌的一種單一的特異性抗體。McAb已廣泛用于寄生蟲(chóng)種株分型與鑒定，蟲(chóng)體結(jié)構(gòu)與功能分析，免疫病理研究，分析、純化抗原以及制備保護(hù)性疫苗等。利用McAb檢測(cè)循環(huán)抗原、以診斷瘧疾、，弓形蟲(chóng)病、血吸蟲(chóng)病、肺吸蟲(chóng)病、棘球蚴病、絲蟲(chóng)病等國(guó)內(nèi)外已有報(bào)告。   

第三節(jié)  分子生物學(xué)診斷技術(shù)技術(shù)

 新近發(fā)展的分子生物學(xué)診斷技術(shù)即基因和核酸診斷技術(shù)，在寄生蟲(chóng)病的診斷中顯示了高度的敏感性和特異性，同時(shí)具有早期診斷和確定現(xiàn)癥感染等優(yōu)點(diǎn)。本項(xiàng)技術(shù)主要包括DNA探針（DNA probe)和聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase chain reaction， PCR)兩種技術(shù)。

一、DNA 探針技術(shù)

 DNA 探針（或稱基因探針)是指用同位素、生物素、酶或其他半抗原標(biāo)記的特定DNA片段。在與DNA樣本雜交過(guò)程中，借助上述標(biāo)記物可探察出特異性或差異性DNA。雙鏈DNA的變性和復(fù)性特點(diǎn)是本技術(shù)的基礎(chǔ)。經(jīng)加熱，或在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿作用下，雙鏈DNA氫鍵被破壞，雙股鏈分離，變成單鏈（此即變性)；而當(dāng)條件緩慢變?yōu)橹行曰驕囟认陆担?0oC左右)時(shí)，氫鍵恢復(fù)，分開(kāi)的兩股單鏈又重新合為互補(bǔ)的雙鏈結(jié)構(gòu)（此即復(fù)性)。DNA探針?lè)肿与s交就是將樣本DNA分子經(jīng)上述條件處理后，使其變性為單鏈狀態(tài)，固定在載體硝酸纖維膜上，再與經(jīng)小分子標(biāo)記的DNA探針單鏈分子混合，在一定條件下使它們互補(bǔ)雜交結(jié)合。將未雜交的成分洗脫后，標(biāo)記物顯色，即可觀察結(jié)果。

目前，DNA探針已用于瘧原蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)、賈第蟲(chóng)、錐蟲(chóng)、巴貝斯蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、絲蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)、棘球蚴、豬帶絳蟲(chóng)、肝片吸蟲(chóng)和豬囊蟲(chóng)等蟲(chóng)種的鑒定和相應(yīng)疾病的診斷上。

基因芯片技術(shù)（gene chip)是20世紀(jì)90年代由基因探針技術(shù)發(fā)展而來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。它將集成電路、計(jì)算機(jī)、半導(dǎo)體、激光共聚焦掃描、熒光標(biāo)記探針等技術(shù)結(jié)合為一體，使眾多的寡核苷酸探針有規(guī)律地排列在硅片上（探針密度可達(dá)105/cm2)，用其可與帶有熒光標(biāo)記的DNA樣品雜交，再通過(guò)計(jì)算機(jī)分析熒光信號(hào)獲得待測(cè)DNA樣品的序列信息。基因芯片技術(shù)大大提高了基因探針的檢測(cè)效率。在寄生蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域，本技術(shù)還處于研究之中，目前線蟲(chóng)基因組芯片業(yè)已問(wèn)世。

 二、PCR技術(shù)

 PCR是在引物介導(dǎo)下特異性擴(kuò)增DNA的技術(shù)。它包括模板DNA熱變性解鏈—引物與模板DNA退火—引物延伸3個(gè)步驟的循環(huán)過(guò)程。其基本原理是在實(shí)驗(yàn)條件下，根據(jù)溫度的變化控制DNA解鏈和退火（引物與模板DNA結(jié)合)，在引物啟動(dòng)和DNA聚合酶催化下，合成二引物特定區(qū)域內(nèi)的DNA鏈。上述“解鏈—退火—延伸”3個(gè)連續(xù)步驟為一個(gè)循環(huán)。經(jīng)過(guò)20 ~ 30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，可使引物特定區(qū)段的DNA量增加至少105倍。

此外，PCR具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)便、快速、樣品處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。反應(yīng)過(guò)程可在PCR儀內(nèi)自動(dòng)進(jìn)行。除常規(guī)PCR外，還有諸如RT-PCR、巢氏PCR、復(fù)合PCR、非對(duì)稱PCR和免疫PCR等多種PCR技術(shù)。

目前，PCR技術(shù)多用于寄生蟲(chóng)病的基因診斷，分子流行病學(xué)研究和種株鑒定、分析等領(lǐng)域。已應(yīng)用的蟲(chóng)種包括利什曼原蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、卡氏肺孢子蟲(chóng)、阿米巴、巴貝氏蟲(chóng)、旋毛蟲(chóng)、錐蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)、賈第蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)和絲蟲(chóng)等。

（盧思奇)