實(shí)驗(yàn)十四 白喉棒狀桿菌
白喉棒狀桿菌(白喉?xiàng)U菌，C. diphtheriae)為革蘭陽(yáng)性桿菌，菌體細(xì)長(zhǎng)，粗細(xì)不均，一端或兩端膨大呈棒狀，菌體內(nèi)有異染顆粒，排列不規(guī)則，常呈V、L形或堆積如柵欄狀。白喉?xiàng)U菌無(wú)芽胞、莢膜與鞭毛，異染顆粒和特殊的排列是其主要形態(tài)特征。
白喉?xiàng)U菌需氧或兼性厭氧，在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，在呂氏凝固血清培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速且菌體的異染顆粒明顯；亞碲酸鉀血平板是白喉?xiàng)U菌的選擇鑒定培養(yǎng)基，常用于白喉?xiàng)U菌的生物分型。
白喉?xiàng)U菌能產(chǎn)生白喉外毒素，致白喉。
（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性
【材料與方法】
1．油鏡下觀察白喉?xiàng)U菌革蘭染色示教片及奈瑟(Neisser)染色示教片。
2．觀察白喉?xiàng)U菌在呂氏凝固m.f1411.cn血清斜面、血平板及亞碲酸鉀血平板上的培養(yǎng)特性。
【結(jié)果】
1．革蘭染色片中的白喉?xiàng)U菌為紫色細(xì)長(zhǎng)桿菌，著色深淺不均，排列不規(guī)則；奈瑟染色片中的白喉?xiàng)U菌為淡黃色細(xì)長(zhǎng)桿菌，菌體內(nèi)有深藍(lán)紫色異染顆粒，排列不規(guī)則。
2．白喉?xiàng)U菌在呂氏凝固血清斜面上形成灰白色的菌苔；血平板上的白喉?xiàng)U菌菌落呈圓形，直徑約1mm，灰白色，不透明，光滑，邊緣整齊，輕型菌株的菌落周圍有狹窄的溶血環(huán)；亞碲酸鉀血平板上的白喉?xiàng)U菌的不同型別的菌落可呈灰黑色、灰色或黑色，其他特性與血平板上的菌落相同。
（二)阿伯特(A1bert)染色法
阿伯特染色法是白喉?xiàng)U菌常用的染色法之一，常用于白喉?xiàng)U菌的分離鑒定。
【材料】
1．白喉?xiàng)U菌呂氏凝固血清斜面12～18培養(yǎng)物。
2．阿伯特染液等。
【方法】
1．自斜面取白喉?xiàng)U菌作涂片、干燥及固定。
2．染色：滴加阿伯特染液甲液，染色5min后水洗，再用乙液染色1min，水洗，干后鏡檢。
【結(jié)果】
鏡檢：白喉?xiàng)U菌細(xì)長(zhǎng)，排列不規(guī)則，菌體呈藍(lán)綠色，異染顆粒為藍(lán)黑色。
（三)毒力試驗(yàn)(Elek平板法)
白喉?xiàng)U菌的有毒菌株可產(chǎn)生白喉外毒素，白喉抗毒素可與其特異性結(jié)合，中和白喉外毒素的毒性，可用細(xì)菌培養(yǎng)法和動(dòng)物試驗(yàn)予以證實(shí)。
【原理】
Elek平板毒力試驗(yàn)是一種體外的毒力測(cè)定方法。通過(guò)觀察白喉抗毒素與白喉外毒素的雙向瓊脂擴(kuò)散現(xiàn)象，判斷所培養(yǎng)的白喉?xiàng)U菌的產(chǎn)毒性。
【材料】
1．產(chǎn)毒素的白喉?xiàng)U菌、類白喉?xiàng)U菌及待測(cè)的白喉?xiàng)U菌呂氏血清斜面24h培養(yǎng)物。
2．Elek瓊脂蛋白胨培養(yǎng)基。
3．白喉抗毒素(1000u/m1)、馬或兔血清(無(wú)菌)、無(wú)菌濾紙條(6.0×1.5cm)、無(wú)菌5ml刻度吸管、無(wú)菌平皿及鑷子等。
【方法】
1．將Elek瓊脂蛋白胨培養(yǎng)基10ml加熱融化，待冷至50～55℃時(shí)，加入無(wú)菌的馬或兔血清2ml，立刻混勻，并傾注平板。
2．趁瓊脂未凝固前，用無(wú)菌鑷子將浸有白喉抗毒素(1000u/m1)的濾紙條(盡量使濾紙條上的抗毒素流盡)貼于平板中央，待瓊脂凝固后將平板置37℃溫箱內(nèi)1～2h(平板面朝下)，使培養(yǎng)基略干燥。
3．如圖14-1所示接種細(xì)菌，以接種環(huán)取產(chǎn)毒素白喉?xiàng)U菌、類白喉?xiàng)U菌和待檢的白喉?xiàng)U菌分別以與濾紙條成垂直的方向劃線接種，接種線須密且集中，接種的菌量宜多。若用此法測(cè)未知標(biāo)本需設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(產(chǎn)毒株)及陰性對(duì)照(無(wú)毒株)，一般每個(gè)平板可接種5～6個(gè)標(biāo)本。置37℃培養(yǎng)24、48、72h觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
注意觀察在接種線兩側(cè)距濾紙條約1cm處有無(wú)與接種線呈45°角的白色沉淀線出現(xiàn)。有沉淀者，白喉?xiàng)U菌毒力試驗(yàn)陽(yáng)性，該菌株產(chǎn)生白喉外毒素；無(wú)沉淀線者，白喉?xiàng)U菌毒力試驗(yàn)陰性，該菌株不產(chǎn)生白喉外毒素。
圖14-1 Elek平板毒力試驗(yàn)
（四)動(dòng)物毒力試驗(yàn)
【原理】
白喉外毒素對(duì)機(jī)體組織有損傷作用，使注射局部產(chǎn)生病變；白喉抗毒素可中和白喉外毒素的毒性。
【材料】
1．產(chǎn)毒素的白喉?xiàng)U菌呂氏凝固血清斜面24h培養(yǎng)物。
2．白喉抗毒素、無(wú)菌肉湯、健康白色豚鼠。
3．注射器、針頭(4號(hào))、5ml無(wú)菌刻度吸管、碘酒、酒精、鑷子、剪刀等。
【方法】
1．在菌種管內(nèi)加入4～5ml無(wú)菌肉湯，輕輕將菌苔洗下，制成細(xì)菌懸液(約5億/m1)，吸出，置于無(wú)菌試管內(nèi)。
2．取健康白色豚鼠2只，分別標(biāo)記為試驗(yàn)鼠與對(duì)照鼠。對(duì)照鼠在試驗(yàn)前18～24h自腹腔m.f1411.cn/jianyan/內(nèi)注射白喉抗毒素1000u。
3．給2只豚鼠腹部剃毛，局部皮膚消毒后皮內(nèi)各注射白喉?xiàng)U菌懸液0.1ml。注射后24、48、72h觀察注射部位的局部反應(yīng)。
【結(jié)果】
試驗(yàn)鼠于注射局部呈現(xiàn)紅腫與壞死，對(duì)照鼠的注射局部無(wú)明顯反應(yīng)。待測(cè)白喉?xiàng)U菌的動(dòng)物毒力試驗(yàn)必須設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，每鼠可同時(shí)檢測(cè)6～7個(gè)標(biāo)本。
