原位雜交組化（ISHH)與免疫組織化學(xué)（IHC)結(jié)合法是先后用ISHH和IHC在同一切片或兩個(gè)相鄰切片進(jìn)行染色，這樣就可以同一細(xì)胞中顯示出某種mRNA和相應(yīng)的蛋白、多肽或其它抗原，從而可更好地了解某一基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白、多肽合成的動(dòng)力學(xué)。ISHH與IHC結(jié)合法可以在相鄰切片上分別進(jìn)行ISHH和IHC染色，也可先后在同一切片上進(jìn)行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都獲得理想的結(jié)果，易成功，但易產(chǎn)生空間誤差和樣本誤差。在同一切片上進(jìn)行結(jié)合法可克服這些誤差，但第一次染色總要或多或少地影響第二次染色，使第二次染色不十分理想。由于m RNA易被染色過(guò)程中污染有少量RNase的液體所降解，因而在實(shí)踐中往往首先進(jìn)行原位雜交組化染色，這種次序使結(jié)合法易成功。但在操作方法中應(yīng)注意減少生物活性肽或蛋白的丟失，如在雜交后沖洗中適當(dāng)減低漂洗溫度。
一、同位素原位雜交組化與免疫組化PAP法的聯(lián)合程序
�。�1)切片入PBS沖洗5min，最好是將切片漂洗于滅菌器皿中。
�。�2)0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。
�。�3)0.4%Triton X-100 PBS 15min。
�。�4)1μg/ml蛋白酶K，37℃保溫30min。
�。�5)4%多聚甲醛PBS固定5min 。
�。�6)PBS沖洗2×3min。
�。�7)0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配)10min。
�。�8)2×SSC沖洗10min。
（9)雜交：如是cDNA探針用前需進(jìn)行變性處理，載片法時(shí)將切片在空氣中晾干，加含探針的雜交液10μl于切片上，蓋上22×22mm的硅化蓋片或相當(dāng)大小看蠟?zāi)ぃ?SUP>3H標(biāo)記探針每10μl雜交液含1×105cpm探針，32P或35S標(biāo)記探針每10μl雜交液含5×105cpm探針；如是漂浮切片，則用滅菌吸水紙將切片水份盡量吸干，然后入雜交液，探針濃度和載片法一樣。入雜交液后43℃保溫12～16h。
（10)4×SSc 37℃沖洗10～30min。
�。�11)2×SSC（如為RNA探針則含20μg/ml RNase)37℃沖洗30min。
�。�12)1×SSC和0.1×SSc 37℃分別沖洗30min。
（13)PBS沖洗2×5min。（轉(zhuǎn)錄ISHH)
（14)0.5%H2O2 PBS室溫30min。
�。�15)1%BSA 37℃，30min 。
�。�16)第一抗體，4℃孵育16～24h。
�。�17)PBS沖洗4×5min。
�。�18)第二抗體37℃，1h。
�。�19)PBS沖洗3×5min。
�。�20)兔PAp 37℃，1h 。
�。�21)PBS沖洗3×5min。
�。�22)DAB顯色液5～10min（DAB顯色液：0.05%DAB + 0.03% H2O2 PBS液配)。
（23)PBS沖洗3×5min。如是漂浮切片則將其貼于涂有粘附劑的載片上，晾干。
�。�24)切片入70%，85%，95%和2個(gè)100%酒精脫水，空氣干燥。
�。�25)在暗室涂布乳膠（乳膠配制：乳膠原液：0.6mol/L醋酸胺=1：1)，晾干，裝入自顯影暗盒。
�。�26)4℃曝光：3H標(biāo)記探針4～8周，35S標(biāo)記探針1～4周，32P標(biāo)記探針7～10天。
�。�27)D196顯影液，20℃顯影5～10min。
（28)自來(lái)水沖洗數(shù)秒。
�。�29)F5堅(jiān)膜定影液10min。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com
（30)自來(lái)水沖洗15min。
（31)切片溫箱烤干，脫水，透明，封片。
結(jié)果：蛋白或多肽免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞為棕色胞質(zhì)，而其相應(yīng)mRNA為黑色銀顆粒聚集。
二、非同位素原位雜交組化與免疫組化聯(lián)合法
非同位素標(biāo)記物很多例如：生物素（biotin)，地高辛（Digoxigenin)，汞（mercury)，溴（bromine)和堿性磷酸酶等，其中目前應(yīng)用最多的是生物素和地高辛。將此法與免疫組化PAP法或ABC法聯(lián)合使用，能成功地顯示一些神經(jīng)肽mRNA和神經(jīng)肽的共存與共同分布。向正華等發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶抗地高辛抗體是經(jīng)木瓜蛋白酶處理的，只有抗體的Fab段沒(méi)有Fc段，而免疫細(xì)胞化學(xué)（Immunocytochemistry,ICC)所應(yīng)用的抗體既有Fab段，又有Fc段。由于抗體的這一特性可在ISHH和ICC抗體孵育時(shí)將檢測(cè)核酸的抗地高辛抗體Fab段與檢測(cè)蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片，這樣可明顯縮短ISHH和ICC結(jié)合法的實(shí)驗(yàn)周期，同時(shí)還可以減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)ICC檢測(cè)的蛋白、多肽的損害，使結(jié)合法易成功。為什么兩種抗體可同時(shí)混合孵育切片，這是因?yàn)榭沟馗咝量贵w只有Fab段，而沒(méi)有Fc段。我們知道抗體的抗原決定簇在Fc段，因此第二抗體與第一抗體的結(jié)合是第二抗體的Fab與第一抗體的Fc，所以第一抗體如果只有Fab段沒(méi)有Fc段，那么第二抗體就無(wú)法與一抗結(jié)合。因此實(shí)驗(yàn)中將二種抗體混合孵育切片而不會(huì)產(chǎn)生交叉結(jié)合。以下為此法的原理圖（圖20-5)。
圖20-5 原位雜交細(xì)胞化學(xué)與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)合法
