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實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第一節(jié) 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的原理

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物,再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受激發(fā)…

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物,再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色),可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測定含量(圖3-1)。

圖3-1 紫外光激發(fā)熒光物質(zhì)放射熒光示意圖

用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補(bǔ)體法。

一、直接法

1.檢查抗原法 這是最早的方法,用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合,制成熒光特異性抗體,直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合,在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法很特異和簡便,但一種熒光抗體只能檢查一種抗原,敏感性較差(圖3-2)。

圖3-2 直接法

2.檢查抗體法 將抗原標(biāo)記上熒光素,即為熒光抗原,用此熒光抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng),而將抗體定位檢測出來。

二、間接法

1.檢查抗體法(夾心法)此法是先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng),再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合,抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間,故稱夾心法。

2.檢查抗體法用已知抗原細(xì)胞或組織標(biāo)本的切片,加上待檢血清,如果其中含有切片中某種抗原的抗體,抗體便沉淀結(jié)合在抗原上,再用間接熒光抗體(抗種屬特異性IgG熒光抗體)與結(jié)合在抗原上的抗體反應(yīng)(如檢測人血清中的抗體必需用抗人IgG熒光抗體等),在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)明亮的特異性熒光。此法是檢驗(yàn)血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段(圖3-3)

圖3-3 間接法

3.檢查抗原法雙薄片此法是直接法的重要改進(jìn),先用特異性(對細(xì)胞或組織內(nèi)抗原)抗體(或稱第一抗體)與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng),隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體,再用間接熒光抗體(也稱第二抗體,種特異性)與結(jié)合在抗原上的抗體(是第二抗體的抗原)結(jié)合,形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗全顯著多于直接法,從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原上每個(gè)分子結(jié)合3~5個(gè)分子抗體,當(dāng)此抗體作為抗原時(shí)又可結(jié)合3~5分子的熒光抗體,所以和直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)3至4倍。此法除靈敏性高外,它只需要制備一種種屬間接熒光抗體,可以適用于多種第一抗體的標(biāo)記顯示。這是現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。

三、補(bǔ)體法

1.直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法用抗補(bǔ)體C3等熒光抗體直接作用組織切片,與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補(bǔ)體反應(yīng),而形成抗原抗體補(bǔ)體復(fù)合物---抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復(fù)合物的存在處,此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。

圖3-4 補(bǔ)體法

2.間接檢查組織內(nèi)抗原法常將新鮮補(bǔ)體與第一抗體混合同時(shí)加在抗原標(biāo)本切片上,經(jīng)37℃孵育后,如發(fā)生抗原補(bǔ)體抗體反應(yīng),補(bǔ)體就結(jié)合在此復(fù)合物上,再用抗補(bǔ)體熒光抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反應(yīng),形成抗原抗體—抗補(bǔ)體熒光抗體的復(fù)合物,此法優(yōu)點(diǎn)是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的標(biāo)記顯示。m.f1411.cn/zhuyuan/

四、雙重免疫熒光標(biāo)記法

在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需要同時(shí)檢查兩種抗原時(shí),要進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧话憔捎弥苯臃,將兩種熒光抗體(如抗A和抗B)以適當(dāng)比例混合,加在標(biāo)本上孵育后,按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體,抗A抗體用異硫氰酸熒光素標(biāo)記,發(fā)黃綠色熒光;抗B抗體用TMRITC或RB200標(biāo)記,發(fā)紅色熒光,可以明確顯示兩種抗原的定位。

五、對照試驗(yàn)

為了保證免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色的準(zhǔn)確性,排除某些非特異性染色,必須在初次試驗(yàn)時(shí)進(jìn)行以上對照試驗(yàn):

1.直接法 需設(shè)下述對照試驗(yàn)

(1)標(biāo)本自發(fā)熒光對照:標(biāo)本只加PBS或不加PBS,緩沖甘油封片,熒光顯微鏡觀察應(yīng)呈陰性熒光(無與特異性熒光相似的熒光)。

(2)抑制試驗(yàn):可分為二步法和一步法。

①二步抑制法:標(biāo)本先加未標(biāo)記的特異性抗體,再加標(biāo)記熒光抗體,結(jié)果應(yīng)呈陰性或明顯減弱的熒光。

②一步抑制法:先將熒光抗體用未標(biāo)記抗體作適量混合,再加在標(biāo)本上染色,結(jié)果應(yīng)為陰性。此法效果較二步法好,并且簡便。

(3)陽性對照:用已知陽性標(biāo)本作直接法免疫熒光染色,結(jié)果應(yīng)呈陽性熒光。

如對照(1)和(2)無熒光或弱熒光,(3)和待檢查標(biāo)本呈強(qiáng)熒光即為特異性陽性熒光。

m.f1411.cn/zhicheng/

2.間接法

(1)自發(fā)熒光對照:同上(一)。

(2)熒光抗體對照:標(biāo)本只加間接熒光抗體染色,結(jié)果陰性。

(3)抑制試驗(yàn):同上。

(4)陽性對照:同上。

如對照(1)、(2)、(3)均呈陰性,陽性對照和待檢標(biāo)本陽性則為特異性熒光。

3.補(bǔ)體法

(1)自發(fā)熒光對照

(2)熒光抗體對照

(3)抑制試驗(yàn)

(4)補(bǔ)體對照:取新鮮豚鼠血清1:10稀釋先作用標(biāo)本,再用抗補(bǔ)體熒光抗體染色,結(jié)果陰性。

(5)抑制試驗(yàn):標(biāo)本加滅活的第一抗體,再用1:10稀釋度的新鮮豚鼠血清孵育后,再加未標(biāo)記的抗補(bǔ)體血清與抗補(bǔ)體熒光抗體等量混合稀釋液,結(jié)果應(yīng)為陰性。

(6)陽性對照:(1)~(5)結(jié)果陰性,(6)和待檢標(biāo)本陽性時(shí),則為特異性熒光。

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