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實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第七節(jié) 消化管壁內(nèi)神經(jīng)叢的免疫細(xì)胞化學(xué)

胃腸道(包括膽囊及肝外膽道)的植物性神經(jīng)分布有二個(gè)來源:①外源性神經(jīng)(extrinsic nerve),指神經(jīng)來自胃腸道以外的其它部位。②內(nèi)源性神經(jīng)(intrinsic nerve),指神經(jīng)來自胃腸及膽道壁內(nèi)的神經(jīng)叢。要應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對(duì)消化道內(nèi)源性神經(jīng)進(jìn)行研究,必須先了解消…

胃腸道(包括膽囊及肝外膽道)的植物性神經(jīng)分布有二個(gè)來源:①外源性神經(jīng)(extrinsic nerve),指神經(jīng)來自胃腸道以外的其它部位。②內(nèi)源性神經(jīng)(intrinsic nerve),指神經(jīng)來自胃腸及膽道壁內(nèi)的神經(jīng)叢。要應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對(duì)消化道內(nèi)源性神經(jīng)進(jìn)行研究,必須先了解消化管壁內(nèi)神經(jīng)叢的結(jié)構(gòu)。

一、內(nèi)源性神經(jīng)的結(jié)構(gòu)

內(nèi)源性神經(jīng)系指消化道的壁內(nèi)神經(jīng)叢。在胃腸道的壁內(nèi)神經(jīng)叢包括兩個(gè)主要的神經(jīng)叢:肌間神經(jīng)叢(Auerbach叢)和粘膜下叢(Meissner叢)。有的作者建議將粘膜下叢分為:最近腸粘膜肌面的Meissner叢,最近環(huán)肌內(nèi)表面的稱Henel叢,F(xiàn)較普遍采取的Furnes 和Com.f1411.cn/rencai/sta 的建議,將壁內(nèi)神經(jīng)叢分為粘膜叢、粘膜下叢、肌深叢、肌間神經(jīng)叢和漿膜下叢(圖13-1)。神經(jīng)節(jié) 主要位于肌間神經(jīng)叢和粘膜下叢。神經(jīng)叢由神經(jīng)節(jié) 和節(jié) 間連接來組成,節(jié) 間連接束連接散在分布、形狀不規(guī)則的神經(jīng)節(jié) ,組成圖案樣的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些神經(jīng)叢自食管下端的平滑肌部起,一直延伸到肛門的括約肌部,并與膽囊及肝外膽道的壁內(nèi)神經(jīng)叢相互連接,形成一個(gè)局部的神經(jīng)系統(tǒng)。因此,早在19世界初期,Langley就建議將胃腸道這個(gè)局部的神經(jīng)系統(tǒng)命名為腸道神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous sys-tem),并建議作為植物性神經(jīng)系統(tǒng)中的,與交感和副交感神經(jīng)系統(tǒng)并列的第三個(gè)部分。隨著近代組織學(xué)技術(shù)的發(fā)展,大量實(shí)驗(yàn)資料證明,腸道神經(jīng)系統(tǒng)的獨(dú)特性,組織連接的復(fù)雜性和神經(jīng)細(xì)胞類型的多樣性,確實(shí)不同于其它兩部分植物神經(jīng)系統(tǒng)。

圖13-1 腸道神經(jīng)叢分布模式圖

(一)神經(jīng)叢的模式

在胃腸道及膽道的分層鋪片,用鍍銀、甲基藍(lán)、乙酰膽堿脂酶(Ache )和菸堿腺嘌呤雙核苷酸黃遞酶(Nicotinamide adenine dinucleotidediaphorase , NADH)染色法,可以見到壁內(nèi)神經(jīng)叢的全貌。由于胃腸道各段神經(jīng)節(jié) 的大小、形態(tài)不同,節(jié) 間連接束的粗細(xì)和長(zhǎng)短的不同,神經(jīng)叢的模式因胃腸道的不同部位、動(dòng)物的種屬不同而異。甚至在同一腸段,如結(jié)腸近腹膜附著方向,神經(jīng)叢的分布遠(yuǎn)離腹膜附著的方向密集。胃小彎部神經(jīng)叢的分布密集,神經(jīng)節(jié) 較大,而胃大亦部神經(jīng)的分布極少或無,胃腸道的粘膜下叢的神經(jīng)節(jié) 小,分布較較稀疏,與膽道的神經(jīng)叢相似。

(二)神經(jīng)元的數(shù)目和大小

胃腸道各段的神經(jīng)細(xì)胞密度(每平方厘米胃腸道壁所含的神經(jīng)細(xì)胞數(shù))也有不同,雖因染色方法和腸道擴(kuò)張度的不同,各家報(bào)告數(shù)字略有不同。一般神經(jīng)細(xì)胞的密度似與胃腸道肌層厚度有關(guān)。肌層愈厚,神經(jīng)細(xì)胞密度愈高。在哺乳類動(dòng)物,結(jié)腸的神經(jīng)細(xì)胞密度較小腸高。動(dòng)物愈大,神經(jīng)節(jié) 分布愈稀疏,單位面積內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞也愈低。在出生后的發(fā)育過程中,肌間神經(jīng)叢內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞逐漸增加。新生大鼠小腸神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)為420000,至成年時(shí)增為1850000。而在小腸的單位面積內(nèi)的神經(jīng)元數(shù),在新生小鼠為64345個(gè)/cm2,在成年僅為9405個(gè)/cm2。換而言之,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)的增長(zhǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于腸道肌層的發(fā)育。至于出生后神經(jīng)叢內(nèi)新生神經(jīng)細(xì)胞的來源,是通過神經(jīng)細(xì)胞的分裂或其它細(xì)胞的分化還是一個(gè)有待探索的問題。

與其它植物性神經(jīng)節(jié) 相比,壁內(nèi)神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞大小的變異較為明顯。肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞大小的變異較粘膜下叢更為明顯,如在大鼠腸的神經(jīng)叢內(nèi),神經(jīng)細(xì)胞的表面積為100~200μm2。小腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)的小神經(jīng)細(xì)胞明顯多于大神經(jīng)細(xì)胞,而在胃腸道其它各段,則以大神經(jīng)細(xì)胞居多。神經(jīng)細(xì)胞大小的變異是否代表不同功能的神經(jīng)細(xì)胞亞群,尚不清楚。

(三)神經(jīng)細(xì)胞的類型

依形態(tài)學(xué)分類:Dogiel建議將腸道神經(jīng)元分為三種類型:

1、I型具有許多短的、不規(guī)則的樹突和一根細(xì)而長(zhǎng)的軸突。

2、II型有一個(gè)短而局限于節(jié) 內(nèi)軸突和許多長(zhǎng)的延伸到神經(jīng)節(jié) 外的樹突。

3、III型具有中等長(zhǎng)短的樹突,終止于同一或鄰近的神經(jīng)節(jié) 。

Dogiel認(rèn)為I型屬運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,II型屬感覺神經(jīng)元。腸道神經(jīng)節(jié) 內(nèi)存在dogiel I型和II型細(xì)胞,還存在其它的中間型細(xì)胞,如在的粘膜下神經(jīng)叢中,單極和雙極的神經(jīng)細(xì)胞占83%,多極的神經(jīng)細(xì)胞占17%。這說明腸道神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的多樣性。然而對(duì)于其形態(tài)與功能的相關(guān)性,是否I型與II型分別代表感覺及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,多數(shù)學(xué)者持懷疑態(tài)度。

依所含化學(xué)物質(zhì)分類:可分為含乙酰膽堿神經(jīng)細(xì)胞、含胺神經(jīng)細(xì)胞、含嘌呤核苷酸神經(jīng)細(xì)胞和含多肽神經(jīng)細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是顯示含多肽神經(jīng)細(xì)胞的有力工具,F(xiàn)已知在消化管壁內(nèi)神經(jīng)叢內(nèi)含有血管活性腸肽、生長(zhǎng)抑素、物質(zhì)P和腦啡肽等多肽。用雙重免疫染色法可證明一種以上的多肽共存于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)。

二、消化道全層鋪片技術(shù)

用消化道切片結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)染色固然能顯示壁內(nèi)神經(jīng)叢的神經(jīng)細(xì)胞及m.f1411.cn/shouyi/纖維。但由于壁內(nèi)神經(jīng)叢為扁平的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),欲窺其全貌,則以消化道全層鋪片技術(shù)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色效果最佳。消化道全層鋪片在英文文獻(xiàn)中通常稱為whole mount stretch preparation,即整裝撕片。即根據(jù)消化管壁內(nèi)神經(jīng)叢的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),分縱層肌、環(huán)層肌、粘膜下層等分層撕開鋪片,以暴露不同的壁內(nèi)神經(jīng)叢。以腸道為例,簡(jiǎn)述消化道的分層鋪片技術(shù)。

動(dòng)物麻醉后,用Zamboin’s液行主動(dòng)脈灌注固定,剖腹取任何一段腸管放入上述固定液中4下3h,然后移至4%多聚甲醛液固定3h,再移至20%蔗糖4過夜,于次日行全層鋪片。選擇一大小適宜的吸管或玻棒穿入腸管,使其被動(dòng)擴(kuò)張,然后用鐘表鑷在腸系膜附著處沿腸管縱軸劃痕,用鑷尖沿劃痕輕輕剝離分離縱肌層,將剝離的縱肌層放在載玻片上(漿膜面向下)。在解剖顯微鏡下,用鑷尖輕挑去附于神經(jīng)叢上的環(huán)層肌,即得縱、環(huán)肌之間的肌間神經(jīng)叢。再將腸管的粘膜面向外翻套在吸管或玻棒上,用鑷子或手術(shù)刀反復(fù)刮去表面的上皮層,即可獲固有層表面的粘膜叢,重刮時(shí)刮去表面的粘膜層,即可暴露粘膜下層的粘膜下神經(jīng)叢。

撕片放入0.1mmol/L的PBS溶液中,等待進(jìn)行免疫染色。其步驟與切片染色同,只是由于撕片較厚,為增強(qiáng)抗體的穿透性,常于染色前在系列酒精中反復(fù)脫水后,再進(jìn)行免疫染色。一般撕片進(jìn)行免疫染色地漂浮法為佳,可增加壁內(nèi)神經(jīng)叢與抗血清的接觸。如撕片數(shù)量少,為節(jié) 約抗血清也可用載片法,此時(shí)載玻片上需涂抹一層粘附劑如鉻礬明膠或多聚賴氨酸,以免撕片在染色過程中脫落。

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