為研究免疫細(xì)胞的功能，常需高純度的淋巴細(xì)胞或其亞群，分離方法介紹如下。
一、純淋巴細(xì)胞群的采集
通常利用單核細(xì)胞在37℃和Ca2+存在條件下，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性，據(jù)此建立許多從單個核細(xì)胞懸液中去除單核細(xì)胞的方法，藉以獲得高純度的淋巴細(xì)胞群。
（一)粘附貼壁法
將已制備的單個核細(xì)胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細(xì)胞幾乎為純淋巴細(xì)胞，繼用橡皮刮下貼壁的細(xì)胞即為純單核細(xì)胞群。因B細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法分離的淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞有所損失。
（二)吸附柱過濾法
將單個核細(xì)胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層中，凡有粘附能力的細(xì)胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗脫下來的細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞。此法簡單易行，對細(xì)胞極少損害。
（三)磁鐵吸引法
利用單核細(xì)胞具有吞噬的特性，在單個核細(xì)胞懸液中加直徑為3μm的羰基鐵顆粒，置37℃溫箱內(nèi)短時旋轉(zhuǎn)搖動，待單核細(xì)胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細(xì)胞。
二、淋巴細(xì)胞亞群的分離
分離相當(dāng)純化的淋巴細(xì)胞亞群是細(xì)胞免疫檢驗的基本技術(shù)。其原則是根據(jù)相應(yīng)細(xì)胞的特性和不同的標(biāo)志加以選擇性純化。凡根據(jù)細(xì)胞的特性和標(biāo)志選擇純化所需細(xì)胞的方法是陽性選擇法；而選擇性去除不要的細(xì)胞，僅留下所需的細(xì)胞是為陰性選擇。常用以下幾種方法：
（一)E花環(huán)沉降法
本法是將淋巴細(xì)胞與一定比例的綿羊紅細(xì)胞混合，待淋巴細(xì)胞形成E花環(huán)后，繼用淋巴細(xì)胞分層液分離細(xì)胞。浮懸在分層界面而不形成E花環(huán)的群則富含B細(xì)胞，而沉降在管底的形成E花環(huán)的細(xì)胞用低滲法處理，使圍繞細(xì)胞周圍的綿羊紅細(xì)胞快速裂解，則獲得純的T細(xì)胞。
（二)尼龍毛分離法
本法利用B細(xì)胞和單核細(xì)胞具有易粘附于尼龍纖維表面的特性，可將T和B細(xì)胞分開。操作原則是取松散而經(jīng)過處理的尼龍毛（聚酰胺纖維)，均勻充填在內(nèi)徑5～6nm的聚乙烯塑料管（飲料管即可)內(nèi)，經(jīng)Hanks液浸透保溫，將單個核細(xì)胞懸液加入柱內(nèi)，放37溫箱靜置1～2h。用預(yù)溫的含10％～20％小牛血清培養(yǎng)液灌洗，洗脫液內(nèi)含有非粘附的T細(xì)胞，重復(fù)灌洗幾次以除去管內(nèi)殘留的T細(xì)胞。再用冷或溫培養(yǎng)液邊沖邊洗邊擠壓塑料管，此時洗脫液內(nèi)富含B細(xì)胞。如此得到的T細(xì)胞純度在90％以上，B細(xì)胞純度可達(dá)80％。
（三)親和板結(jié)合分離法
利用親和層析法分離淋巴細(xì)胞亞群，其原理是各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同的抗原性，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，繼加細(xì)胞懸液，凡抗原陽性的細(xì)胞則與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原陰性的細(xì)胞可從未吸附的細(xì)胞懸液中獲�。▓D20-3)。同樣若用特異性抗原交聯(lián)在塑料板上，則可分離得具有特異抗原受體的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞受體與特異抗原或抗體接觸，可引起細(xì)胞激活，因此，凡欲去除細(xì)胞懸液內(nèi)某一細(xì)胞亞群時，本法更適用。如要分離CD4+或CD8+細(xì)胞，則可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。用抗Ig抗體則可分離B細(xì)胞。同樣，用活化的C3包被，可分離出有C3受體的細(xì)胞。
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圖20-3 親和分離法圖解
（四)熒光激活細(xì)胞分離儀分離法
熒光激活細(xì)胞分離儀（fluorescenceactivatedcellsorter，F(xiàn)ACS)主要由4部分組成：①細(xì)胞流動系統(tǒng)及氣壓流速控制系統(tǒng)，②激光系統(tǒng)，③檢測與訊號處理系統(tǒng)，④細(xì)胞分選系統(tǒng)。其主要原理是細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行，逐個流經(jīng)m.f1411.cn/jianyan/檢測區(qū)進(jìn)行測定。當(dāng)細(xì)胞從流動室噴嘴處流出時，超聲振蕩攪動液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴（40000個/s)，每小滴內(nèi)最多含一個細(xì)胞（其中只有百分之幾的液滴中含細(xì)胞)，細(xì)胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞的類型。如識別的是預(yù)計所需的細(xì)胞時（如T細(xì)胞、B細(xì)胞要其亞群)，在細(xì)胞樣品流斷裂成小滴時，使液m.f1411.cn/zhuyuan/滴瞬即感應(yīng)陽電荷、陰電荷或不帶電荷，使所需的細(xì)胞在電場偏轉(zhuǎn)下進(jìn)入不同的收集管（圖20-4)。用FACS分離細(xì)胞準(zhǔn)確快速，能保持細(xì)胞活力，并可在無菌條件下進(jìn)行，但儀器昂貴，極少用于常規(guī)，而多數(shù)僅作為研究的手段。
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圖20-4 熒光激活細(xì)胞分離儀簡圖
