現(xiàn)代分子生物學(xué)無論是在理論研究還是實際應(yīng)用上，都已處于生命科學(xué)的最前沿，它的發(fā)展徹底改變了我們對生物體的認(rèn)識。這些發(fā)展對于研究和治療人類的疾病，尤其是性病有著重大的意義。分子生物學(xué)使我們重新認(rèn)識性病的發(fā)生和發(fā)病機理。在探討性病的診斷和治療以及有關(guān)預(yù)防疫苗的研制等各方面，都采用了分子生物技術(shù)和方法。利用分子生物學(xué)方法對各種性傳播性疾病進行病原學(xué)診斷，是近年來的主要進展之一。它的優(yōu)點是高度的特異性和極大的提高了檢測的敏感性�？梢詸z測到標(biāo)本中只有一個基因拷貝的病原微生物。用分子生物學(xué)方法診斷那些培養(yǎng)困難的病原微生物顯得更為優(yōu)越。此外，還可以用來進行流行病學(xué)、發(fā)病機理及藥物治療監(jiān)測的研究�，F(xiàn)將基因診斷的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及在性病領(lǐng)域常用的有關(guān)分子生物學(xué)的基本方法和原理進行概述。
基因診斷操作的對象為基因或其片段。基因是遺傳學(xué)上的一個概念，是在染色體上占有一定的位置，表現(xiàn)一定功能的基本單位�；虻奈镔|(zhì)基礎(chǔ)是脫氧核糖核酸（DNA)（有些病毒的基因是核糖核酸，RNA)。原核細(xì)胞（如細(xì)菌和病毒)的基因單位較小，其排布一般是連續(xù)的。真核細(xì)胞的基因一般較大，其排布是不連續(xù)的，它被稱為插入序列的部分所分隔。
DNA和RNA統(tǒng)稱為核酸，早在1868年就被瑞士年輕醫(yī)生米歇爾發(fā)現(xiàn)，在真核細(xì)胞中，98%以上的DNA存在于細(xì)胞核，少量的DNA分布在線粒體中。RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，占其總量的90%左右。細(xì)胞外液則無核酸存在。對于非細(xì)胞形態(tài)的病毒來說，或含有DNA，或只含有RNA，因此可按所含核酸類型的不同，將病毒分為DNA病毒與RNA病毒。
組成核酸的基本單位是單核苷酸，所以核酸又稱為多核苷酸。單核苷酸是由磷酸、戊糖及堿基組成。如果戊糖是脫過氧的，則形成的單核苷酸為脫氧單核苷酸。單核苷酸相互縮合形成RNA，脫氧單核苷酸相互縮合形成DNA。下表列舉常見的核苷酸及縮寫符號。
表1－1 常見核苷酸及其縮寫符號
| 堿 基 | 核糖核苷酸（縮寫) | 脫氧核糖核苷酸（縮寫) |
| 腺 嘌 呤 | 腺嘌呤核苷酸（AMP) | 腺嘌呤脫氧核苷酸（dAMP) |
| 鳥 嘌 呤 | 鳥嘌呤核苷酸（GMP) | 鳥嘌呤脫氧核苷酸（dGMP) |
| 胞 嘧 啶 | 胞嘧啶核苷酸（CMP) | 胞嘧啶脫氧核苷酸（dCMP) |
| 尿 嘧 啶 | 尿嘧啶核苷酸（UMP) | 胸腺嘧啶脫氧核苷酸（dTMP) |
由于核酸的合成是一個耗能的過程，故參與DNA或RNA合成的脫氧或未脫氧的單核苷酸是三磷酸核苷酸，合成時磷酸鍵水解釋放出能量，以供核酸的合成。
表1－2 三磷酸核苷酸的種類及符號
| DNA | RNA |
| 腺嘌呤脫氧三磷酸核苷酸（dATP) | 腺嘌呤三磷酸核苷酸（ATP) |
| 鳥嘌呤脫氧三磷酸核苷酸（dGTP) | 鳥嘌呤三磷酸核苷酸（GTP) |
| 胞嘧啶脫氧三磷酸核苷酸（dCTP) | 尿嘧啶三磷酸核苷酸（UTP) |
| 胸腺嘧啶脫氧三磷酸核苷酸（dTTP) | 胞嘧啶三磷酸核苷酸（CTP) |
（一)DNA的堿基組成規(guī)律
組成DNA分子的脫氧核苷酸主要有四種，即dAMP，dGMP、dCMP和dTMP（d代表“脫氧”的意思)，此外還含有少量的稀有堿基（主要是甲基化堿基)。50年代初，E.Chargaff等人對來自不同生物的DNA進行完全水解，對堿基進行了定量測定，總結(jié)出如下規(guī)律，一般稱它為Chargaff規(guī)則。
1．所有DNA分子中，嘌呤堿總摩爾數(shù)等于嘧啶堿總摩爾數(shù)，即A+G=T+C，并且以摩爾為單位，A=T、G=C。
2．DNA的堿基組成具有種屬的特異性，即不同生物種屬的DNAm.f1411.cn/hushi/具有各自獨特的堿基組成。
3．DNA的堿基組成沒有組織、器官的特性，即同種生物中不同組織及器官的DNA在堿基組成上是一致的。
4．生物體內(nèi)DNA的堿基組成不受年齡、營養(yǎng)狀態(tài)和環(huán)境的改變之影響。在所有DNA分子中A=T、G=C這一規(guī)律的發(fā)現(xiàn)，為DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立提供了重要的依據(jù)。
（二)DNA的一級結(jié)構(gòu)
與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，核酸的結(jié)構(gòu)也可分一級結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)進行討論。核酸的一級結(jié)構(gòu)是指其多核苷酸鏈中核苷酸的排列順序。核酸的空間結(jié)構(gòu)是指多核苷酸鏈內(nèi)或鏈間通過氫鍵等折疊卷曲的構(gòu)象。核酸的空間結(jié)構(gòu)又有二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)之分。
DNA是由四種脫氧核糖核酸通過3′.5′——磷酸二酯鍵彼此連接而成的線形或環(huán)狀大分子。DNA分子沒有側(cè)鏈。其骨架由脫氧核糖和磷酸組成DNA的一級結(jié)構(gòu)即是DNA多核苷酸鏈中核苷酸的排列順序。
由于生物遺傳信息儲存于DNA的核苷酸序列中，若能搞清各種生物DNA的脫氧核苷酸排列順序，則對生命活動本質(zhì)的認(rèn)識將有重大意義。
（三)DNA的二級結(jié)構(gòu)
目前公認(rèn)的DNA二級結(jié)構(gòu)是雙螺旋結(jié)構(gòu)，這種模型的建立，主要有兩個方面的根據(jù)。一是前面提到的50年代初E.Chargaff等人對各種DNA堿基組成的定量分析結(jié)果。二是Wilkins小組用X光衍射法研究DNA的晶體,測得DNA分子呈螺旋結(jié)構(gòu)。1953年j .Watson和F.Crick通過進一步研究,提出了DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。從而大大推動了分子生物學(xué)的發(fā)展。
DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點如下：
1．DNA分子由兩條走向相反（一條5′→3′，另一條3′→5′)但互相平行的脫氧核糖核苷酸鏈組成，以一共同軸為中心，盤繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)。
2．堿基在雙螺旋內(nèi)側(cè)。一條鏈堿基上-NH的氫原子與另一條鏈堿基上的氧原子或氮原子形成氫鍵。氫鍵總是發(fā)生在A與T，G與C之間，前者有兩個氫鍵，后者有三個氫鍵。這稱為堿基配對或堿基互補規(guī)律。由此，兩條多核苷酸鏈又可稱為互補鏈。
3．各堿基對處于同一平面，且垂直于雙螺旋的中心軸。相鄰堿基對之間尚存在范德華（Vander Warls)引力，從而進一步穩(wěn)定了雙螺旋結(jié)構(gòu)。
4．雙螺旋的直徑為2nm，每個螺距為3.4nm，內(nèi)包含10個堿基對，因此每個堿基對距離為0.34 nm。
（四)DNA的三級結(jié)構(gòu)
DNA三級結(jié)構(gòu)是指雙螺旋鏈作進一步的扭曲構(gòu)象。超螺旋結(jié)構(gòu)是DNA三級結(jié)構(gòu)形式。目前發(fā)現(xiàn)許多病毒DNA，線粒體DNA，都是環(huán)型雙鏈DNA，而具有超螺旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)超螺旋型DNA的一條鏈上出現(xiàn)缺口時，超螺旋結(jié)構(gòu)被松開，可解旋形成開環(huán)型結(jié)構(gòu)。
DNA的三級結(jié)構(gòu)與其結(jié)合的蛋白質(zhì)有關(guān)。真核細(xì)胞染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體。核小體是由組蛋白H2A，H2B，H3和H4各二個分子組成的八聚體，外繞DNA形成核心顆粒。連接各核心顆粒的區(qū)域稱連接區(qū)，它是由組蛋白H1及大約60-100個堿基對DNA組成。一個完整的核小體由核心顆粒與連接區(qū)組成。各個核小體彼此相聯(lián)沿染色質(zhì)纖維的縱軸列成一種串珠狀重復(fù)性結(jié)構(gòu)。串珠狀核小體長鏈可進一步卷曲，形成螺旋筒結(jié)構(gòu)。在形成染色單體時，螺旋筒再進一步卷曲、折疊。人體每個細(xì)胞中長約1.7μm的DNA雙螺旋鏈，最終被壓縮8400多倍，分布于各染色單體中。
（一)RNA類型
細(xì)胞內(nèi)含有三類主要的RNA，即核蛋白體RNA（RibosomalRNA， rRNA)、轉(zhuǎn)運RNA（Transfer RNA，tRNA)及信使（Messenger RNA，mRNA)。
1．rRNA。是核蛋白體的組成部分，含量最多，約占細(xì)胞內(nèi)全部RNA的74~80%，在真核細(xì)胞中有四種rRNA，分子大小不均。它們分別與70多種蛋白質(zhì)相結(jié)合而構(gòu)成核蛋白體大小亞基，是蛋白質(zhì)生物合成的“裝配機”。
2．tRNA。占細(xì)胞內(nèi)RNA總量的10~25%，分散于胞液中。種類很多，每種氨基酸都有與
其相對應(yīng)的一種或幾種tRNA。tRNA分子由70~90個核苷酸組成，所以分子量較小，tRNA的生理功能是運輸活化了的氨基酸，參與蛋白質(zhì)的生物合成。
3．mRNA。占細(xì)胞內(nèi)RNA總量的2~5%，其代謝活躍，更新迅速，所以半衰期較短。細(xì)胞內(nèi)mRNA的種類很多，但每種mRNA的含量卻很少，它是蛋白質(zhì)生物合成的直接模板。
（二)RNA的堿基組成
RNA分子中所含的四種基本堿基是：腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外還有一些稀有堿基，如假尿嘧啶及帶有甲基化的堿基等。RNA的堿基組成，不像DNA那樣具有嚴(yán)格的A-T，G-C的規(guī)律。RNA結(jié)構(gòu)也不像DNA那樣整個分子都是雙螺旋結(jié)構(gòu)，而且只有局部呈雙螺旋結(jié)構(gòu)。
（三)RNA分子結(jié)構(gòu)
除少數(shù)病毒外，RNA分子均為單鏈結(jié)構(gòu)。與DNA相似，核苷酸通過3′.5′—磷酸二酯鍵連接而成多核苷酸鏈。單鏈結(jié)構(gòu)的RNA，在局部區(qū)域由于自身回折也可盤曲形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙鏈部位的堿基一般也彼此通過氫鍵而互相配對，即A-U，G-C。有些不參加配對的堿基往往被排斥在雙鏈外，形成環(huán)狀突起。在不同的RNA分子中，雙螺旋區(qū)所占比例也不相同。
1．tRNA結(jié)構(gòu)
在所有RNA中，對tRNA的研究為最多，了解得也較清楚。tRNA的二級結(jié)構(gòu)多呈三葉草形。由于雙螺旋結(jié)構(gòu)所占比例甚高，所以三葉草形結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定。tRNA是核蛋白體的組成部分。目前雖已測出不少的tRNA分子的一級結(jié)構(gòu)，但對二級結(jié)構(gòu)與其功能的研究還需進一步深入。
2．mRNA結(jié)構(gòu)
mRNA分子結(jié)構(gòu)的特點是，極大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA的3′—端有一段長約200個堿基的多聚腺苷酸，稱為mRNA的“尾”。這種結(jié)構(gòu)可能與mRNA在細(xì)胞核內(nèi)合成后移至細(xì)胞質(zhì)的過程有關(guān)。在mRNA分子的5′—端接一個7-甲基鳥嘌呤核苷三磷酸，稱它為mRNA的“帽”。mRNA分子中有編碼區(qū)與非編碼區(qū)。編碼區(qū)是所有mRNA分子的主要結(jié)構(gòu)部分，決定蛋白質(zhì)分子一級結(jié)構(gòu)。非編碼區(qū)與蛋白質(zhì)生物合成的調(diào)控有關(guān)。
3．rRNA結(jié)構(gòu)
rRNA是核蛋白體的組成部分。目前雖已測出了不少的rRNA分子的一級結(jié)構(gòu)，但對二級結(jié)構(gòu)與其功能的研究還需進一步深入。
天然DNA分子的長度可達幾厘米，而分子直徑只有2nm。如此細(xì)絲狀的雙螺旋結(jié)構(gòu)使DNA分子具有一系列理化特性。如粘度極大，在外力作用下易斷裂等。
（一)核酸的分子大小與粘度
天然DNA的分子量極大，例如，果蠅巨染色體只有一線形DNA，長達四厘米，分子量約為8×102道爾頓。高分子溶液的粘度比一般溶液的粘度要大得多，不規(guī)則團分子比球狀分子的粘度要大，而線形分子的粘度更大。因此在溶液中呈線形分子的DNA，即使是極稀的溶液，也具有極大的粘度。RNA溶液的粘度要小得多。當(dāng)核酸溶液在某些理化因素作用下發(fā)生變性，使螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榫�團時，粘度降低。所以可用粘度作為DNA變性的指標(biāo)。
（二)核酸的紫外吸收
嘌呤堿、嘧啶堿以及由它們參與組成的核苷，核苷酸及核酸對紫外光都有強烈的吸收作用。它們吸收紫外光的共同特點是在260nm處為最大吸收值。而由芳香族氨基酸參與組成的蛋白質(zhì)最大吸收值在280nm處。利用這一特性，可以鑒別核酸樣品作為雜質(zhì)的蛋白質(zhì)含量。
（三)核酸的變性、復(fù)性與雜交
1．核酸變性
核酸變性是指核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，氫鍵斷裂，但并不涉及核苷酸間磷酸二酯鍵的斷裂。若磷酸二酯鍵的斷裂稱為降解，核酸降解時，核酸分子量降低。而核酸的變性并不引起核酸分子量的變化。
引起核酸變性的因素很多。由于溫度升高而引起的變性稱熱變性。如將DNA的稀鹽溶液加熱到50℃以上幾分鐘，雙螺旋結(jié)構(gòu)即破壞，氫鍵斷裂，DNA分子的兩條鏈彼此分離，形成無規(guī)則線團。變性后的DNA，由于結(jié)構(gòu)上的變化，因而發(fā)生了一系列理化性質(zhì)的改變，如260nm處紫外吸收值升高（稱增色效應(yīng))，粘度降低以及生物學(xué)活性喪失等。能使50%DNA分子發(fā)生變性的溫度稱為變性溫度（Melting temperature，Tm)Tm一般為70~85℃。Tm值與分子中G—C含量有關(guān)，即G—C配對數(shù)愈多，則Tm值愈高，反之愈低。由于溶液酸堿度的改變而引起的變性稱酸堿變性。對DNA分子來說，堿基對在pH4.0~11.0之間最為穩(wěn)定,超此范圍,可引起DNA分子酸堿變性。乙酸、丙酮等有機溶液及尿素也可引起核酸的變性。
2．核酸復(fù)性
變性DNA在適當(dāng)條件下，又可使兩條彼此分離的鏈重新締合而形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性或退火。復(fù)性后的DNA可基本恢復(fù)一系列的理化性質(zhì)，生物學(xué)活性也可得到部分恢復(fù)。
變性核酸的復(fù)性是有條件的。如將熱變性的DNA溶液驟然冷低溫，DNA不可能復(fù)性。只有緩慢地將它冷卻時，DNA才有可能復(fù)性。另外，變性DNA片段越大，則復(fù)性越慢。變性DNA濃度越大則越易復(fù)性。
3．核酸雜交
不同來源的DNA加熱變性后，只要兩條多核苷酸鏈的堿基有一定數(shù)量能彼此互補，就可以經(jīng)退火處理復(fù)性現(xiàn)象，形成新的雜交體雙螺旋結(jié)構(gòu)，這種依據(jù)相應(yīng)堿基配對而使不完全互補的兩條鏈相互結(jié)合稱為分子雜交。因此分子雜交的基礎(chǔ)是DNA的變性與互補，也可以雜交形成新的雙螺旋結(jié)構(gòu)。目前雜交技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究。將已知的特定基因（如先天性遺傳疾病的某些特定基因)用同位素標(biāo)記，制備成基因探針，利用分子雜交技術(shù)，基因探針可與同源序列互補形成雜交體，因此可用檢測組織細(xì)胞內(nèi)有無特定基因或DNA片段，如臨床上已應(yīng)用于產(chǎn)前診斷遺傳性疾病。
DNA作為遺傳物質(zhì)的基本特點就是能夠準(zhǔn)確地自我復(fù)制，而DNA的互補雙螺旋結(jié)構(gòu)對于維持這類遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和復(fù)制的準(zhǔn)確性都是極為重要的。
（一)DNA復(fù)制的方式
從前面的內(nèi)容可知，DNA是由兩條互補的多核苷酸鏈組成的，其中一條鏈上的核苷酸排列順序可以決定另一條鏈上的核苷酸順序。據(jù)此推測，在復(fù)制過程中，首先DNA雙螺旋的兩條多核苷酸鏈之間氫鍵斷裂，雙鏈解開，然后每條鏈各自作為模板，以脫氧核糖核苷酸為原料，按照堿基配對規(guī)律，合成新的互補鏈。這樣形成的兩個子代DNA分子與原來的親代DNA分子的核苷酸順序完全相同。在此過程中，每個子代分子的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。實驗證明，DNA半保留復(fù)制的方式是正確的。由于DNA在代謝上的穩(wěn)定性，經(jīng)過許多代的復(fù)制，DNA分子上的遺傳信息仍可傳給后代。
（二)參與復(fù)制的酶類
DNA的復(fù)制過程極為復(fù)雜，但其速度甚快，這是由于許多酶參與了復(fù)制過程。
1．DNA聚合酶（DNApolymerase)。四種脫氧核糖核苷酸（dNTP，N代表A、T、G、C四種堿基)是DNA合成的原料。在原有DNA模板鏈存在時，DNA聚合酶催化四種dNTP通過與模板鏈的堿基互補規(guī)律，合成新的DNA鏈，故此酶又被稱為DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（DNa directed DNA polymerase，縮寫為DDDP)。
值得注意的是，DNA聚合酶不能自行從頭合成DNA鏈，而必須有一個原有的多核苷酸鏈作為引物，DNA聚合酶只能在引物的3′末端上逐步合成DNA鏈。由此可見，DNA鏈的合成方向是從5′端至3′端進行的。
無論在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中，均存在著多種DNA聚合酶，它們的性質(zhì)不完全相同。目前認(rèn)為，在真核細(xì)胞中，DNA聚合酶α在復(fù)制中起關(guān)鍵作用，而DNA聚合酶β主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。
2． 引物酶。由于DNA聚合酶不能自行從頭合成DNA鏈，因此在復(fù)制過程中首先需要合成一小段RNA的多核苷酸鏈作引物，在這段RNA引物的基礎(chǔ)上引導(dǎo)DNA鏈的合成，催化RNA引物合成的酶是引物酶，實際上它是一種特殊的RNA聚合酶。
3．DNA連接酶。因為復(fù)制過程中，DNA鏈的合成方向只能由5′端→3′端方向進行，因此其中有一條新鏈的合成是不連續(xù)的。起初生成的是許多短鏈。需要DNA連接酶將它們連接起來。
4．參與DNA解旋、解鏈的酶及因子。已知DNA具有超螺旋結(jié)構(gòu)。復(fù)制時必須松弛DNA模板的超螺旋結(jié)構(gòu)，并使DNA的雙鏈分開，暴露堿基，否則不可能在模板上按堿基配對原則合成新的互補DNA鏈。松馳模板DNA超螺旋，分開雙鏈主要由拓?fù)洚悩?gòu)酶，解鏈酶及DNA結(jié)合蛋白等來完成。
（三)DNA復(fù)制的過程
DNA復(fù)制大致可分為以下幾個階段。
1．起始與引物RNA的合成
DNA復(fù)制有固定的起始部位，在真核細(xì)胞DNA雙鏈上有多個起始部位。復(fù)制時，解鏈酶等先使DNA的一段雙鏈解開，形成復(fù)制點。這個復(fù)制點的形狀象一個叉子，故稱為復(fù)制叉。引物酶能辯認(rèn)起始部位，并以四種核糖核苷酸為底物，以解開的一段DNA鏈為模板，按5′-3′方向合成RNA片段。在這一階段只合成了引物RNA，為DNA鏈的合成做好了準(zhǔn)備工作。
2．DNA片段的生成
在細(xì)胞內(nèi)，DNA的兩條鏈都可作為模板，同時合成兩條DNA鏈。由于DNA兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模匆粭l鏈?zhǔn)?′→3′方向，而另一條鏈則是3′→5′方向。但是，DNA聚合酶催化DNA鏈的合成只能順著5′→3′方向進行。因此，在新的DNA鏈中有一條連續(xù)合成的（稱前導(dǎo)鏈)，而另一條是不連續(xù)合成的（稱隨從鏈。在隨從鏈合成過程中，先合成的是較短的片段（稱為岡崎片段)，然后將這些片段再連結(jié)起來，形成完整的DNA鏈。岡崎片段的合成方向仍然是5′→3′，反應(yīng)直至下一個引物RNA的5′端為止。
3．RNA引物的水解
DNA片段合成一定長度后，鏈中的RNA引物被核酸酶水解而切掉。此時出現(xiàn)的缺口由DNA片段繼續(xù)延長而填補。
4．完整的DNA分子的形成
相鄰的兩個DNA片段在DNA連接酶作用下連接起來，形成大分子DNA鏈，與其對應(yīng)的模板DNA鏈一起生成子代雙螺旋DNA，即完整的DNA分子。
DNA復(fù)制過程十分準(zhǔn)確，極少發(fā)生錯誤，由此保證了子代DNA與親代DNA分子完全相同，這是遺傳穩(wěn)定性的重要基礎(chǔ)。某些因素可使DNA結(jié)構(gòu)改變，則導(dǎo)致子代DNA結(jié)構(gòu)的相應(yīng)變化，稱為遺傳的變異。
這是最早用于性病診斷的重組DNA技術(shù)�；驹硎蔷哂幸欢ㄍ葱缘膬蓷l核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等)可按堿基互補原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。雜交的雙方是待測核酸及探針。待測核酸序列為性病病原體基因組或質(zhì)粒DNA。探針以放射核素或非放射性核素標(biāo)記，以利于雜交信號的檢測。
所謂雜交（hydridization)指兩個以上的分子因具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)而在適宜的條件下形成雜交體（hybrid)，雜交體中的分子不是來自一個二聚體分子。同一個二聚體中的兩個分子在變性解離后重組合稱為復(fù)性。利用兩條不同來源的多核苷酸鏈之間的互補性而使它們形成雜交體雙鏈叫核酸雜交。與核酸雜交技術(shù)相對應(yīng)的另一項技術(shù)被稱為探針技術(shù)，它是指利用標(biāo)記分子對其它分子的識別性而實現(xiàn)對后者進行檢測的一種技術(shù)，我們把標(biāo)記的分子叫探針（Probe)。將探針技術(shù)與分子雜交技術(shù)相結(jié)合，從而使分子雜交技術(shù)得以廣泛推廣應(yīng)用。目前所用的核酸雜交技術(shù)均應(yīng)用了標(biāo)記技術(shù)。
（一)DNA的變性
DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團，稱為DNA變性。加熱、改變DNA溶液中的pH，或有機溶劑等理化因素的影響，均可使DNA變性。變性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。
（二)DNA復(fù)性
變性DNA只要消除變性條件，二條互補鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。復(fù)性后的DNA，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。
核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價健的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，這是核酸分子雜交的基礎(chǔ)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間，由于DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進行分子雜交時，應(yīng)先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過程稱為變性，一般通過加熱或提高pH值來實現(xiàn)。使單鏈聚合成雙鏈過程稱為退火或復(fù)性。用分子雜交進行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進行分子雜交。
（三)探針——靶分子反應(yīng)
從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測的合適標(biāo)記物，并與特異靶分子反應(yīng)�？贵w——抗體、外源凝集素——碳水化合物、親合素——生物素、受體——配基（Ligand)以及互補核酸間的雜交均屬于探針——靶分子反應(yīng)，蛋白質(zhì)探針（如抗體)與特異靶分子是通過混合力（疏水離子和氫鍵)的作用在少數(shù)特異位點上的結(jié)合，而核酸探針與互補鏈的反應(yīng)則是根據(jù)雜交體的長短不同，通過氫鍵幾十、幾百甚至上千個位點上的結(jié)合。這就決定它的特異性。
基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類，根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類。DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。下面分別介紹這幾種探針。
（一)DNA探針
DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針�，F(xiàn)已獲的DNA探針種類很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細(xì)胞DNA探針，這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細(xì)菌的毒力因子基因探針和人類ALU探針，這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比用G+C百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個發(fā)展方向，加之分子雜交技術(shù)的高度敏感性，分子雜交在臨床性病病原體診斷上具有廣泛的前景。
DNA探針（包括cDNA探針)有三大優(yōu)點：第一，這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。其次，DNA探針不易降解（相對RNA而言)，一般能有效抑制DNA酶活性。第三，DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機引物法、PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。
（二)cDNA探針
cDNA是指互補于mRNA的DNA分子（complementary DNA)。cDNA是由RNA經(jīng)一種稱為逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒侵入宿主細(xì)胞后，病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA，并進而整合入宿主細(xì)胞染色體DNA分子，隨宿主細(xì)胞DNA復(fù)制同時復(fù)制，這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止?fàn)顟B(tài)下，可被復(fù)制多代，但不被表達，故無毒性，一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量復(fù)制。如其帶有癌基因，還可能誘發(fā)細(xì)胞癌變。
逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在已成為一項重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于基因的克隆和表達。從逆轉(zhuǎn)錄病毒中提取的逆轉(zhuǎn)錄酶也已商品化。最常用的有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。利用真核mRNA3′末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸用作引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成互補于mRNA的cDNA鏈，然后再用RNaseH將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈，即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉(zhuǎn)錄過程。
所得到的雙鏈cDNA分子經(jīng)S1核酸酶切平兩端后接一個有限制酶切點的接頭(Adapter),再經(jīng)特定限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與含互補末端的載體進行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA，如λgt、EMBL和Charon 系列等。用這類載體可以得到包含105以上轉(zhuǎn)化子文庫，再經(jīng)前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術(shù)獲得的DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達的檢測。
（三)RNA探針
RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。例如，在篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒人類免疫缺陷病毒（HIV)的基因組DNA克隆時，因無DNA探針可www.med126.com利用，獲得HIV的全套標(biāo)記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。
隨著體外逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)不斷完善，已成功的建立了單向和雙向體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要基于一類新型載體PSP和PGEM，這類載體在多克隆位點兩側(cè)分別帶有SP6啟動子和T7啟動子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可進行RNA轉(zhuǎn)錄。如果在多克隆位點接頭中插入了外源DNA片段，則可以以DNA兩條鏈中的一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA。這種體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率很高，在1小時內(nèi)可合成近10μg的RNA產(chǎn)物。只要在底物中加入適量的放射性或生物素標(biāo)記的dUTP，則所合成的RNA可得高效標(biāo)記。該方法能有效地控制探針的長度并可提高標(biāo)記分子的利用率。
RNA探針和cDNA探針具有DNA探針?biāo)荒鼙葦M的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點。
（四)寡核苷酸探針
前述三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首先進行克隆以便繪制酶譜和測序時，也常應(yīng)用克隆探針�？寺√结樢话爿^寡核苷酸探針的特異性強，復(fù)雜度也高，從統(tǒng)計學(xué)角度而言，較長的序列隨機碰撞互補序列的機會較短序列少�？寺√结樀牧硪粌�(yōu)點是，可獲得較強的雜交信號，因為克隆探針較寡核苷酸探針摻入的可檢測標(biāo)記基因更多。但是，較長的探針對于靶序列變異的識別能力又有所降低。對于僅是單個堿基或少數(shù)堿基不配的兩個序列，克隆探針不能區(qū)分，往往雜交信號相當(dāng)。這既是其優(yōu)點，又是其缺點，優(yōu)點是當(dāng)用于檢測病原微生物時，不會因病毒或細(xì)菌DNA的少許變異而漏診，缺點則是不能用于檢測突變點。這種情況，通常要采用化學(xué)合成的寡核苷酸探針。
合成的寡核苷酸探針具有以下特點：第一，由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，分子量小，所以和等量靶位點完全雜交的時間比克隆探針短。第二，寡核苷酸探針可識別靶序列內(nèi)一個堿基的變化，因為短探針中堿基錯配能大幅度降低雜交體的Tm值。第三，一次可大量合成寡核苷酸探針，使得這種探針價格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。最常用的寡核苷酸探針長18—40個鹼基，目前的合成可有效地合成至少50個堿基的探針。
對于合成的寡核苷酸探針有以下要求：
（1)長度以18-50堿基為宜，較長探針雜交時間較長，合成量也低；較短探針特異性較差。
（2)堿基成分：G+C含量為40%-60%，超出此范圍則會增加非特異雜交。
（3)探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補區(qū)，否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。
（4)避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)。
（5)一旦選定某一序列符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將該序列與核酸庫中的核酸序列比較，探針序列應(yīng)與靶序列核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不應(yīng)超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基的同源。否則，該探針不能用。
分子雜交是核酸鏈以堿基配對規(guī)則的一種結(jié)合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子雜交這一特性來對特定核酸序列進行檢測，必須將雜交鏈中的一條用某種可以檢測的進行標(biāo)記，這條鏈就稱為核酸探針。因此，核酸探針的制備是分子雜交技術(shù)的關(guān)鍵。放射性同位素標(biāo)記是最早采用的也是目前最常用的核酸探針標(biāo)記方法。常用的放射性同位素有32P和35S。32P因其能量高，信號強，所以最常用。放射性同位素標(biāo)記探針雖然敏感度高，但卻存在輻射危害和半衰期限制（32P半衰期為14.3天，35S半衰期為87.1天，125I半衰期為60天)，3H的半衰期長達12.3年，但它所釋放β射線的能量太低，只能用于組織原位雜交。由于同位素標(biāo)記的探針在使用過程中存在著上述缺點，近年來，人們在尋找非放射性標(biāo)記物方面取得了很大進展。國內(nèi)已具備生物素類標(biāo)記物的生產(chǎn)能力，并有相應(yīng)試劑出售。目前非放射性標(biāo)記物有下述幾類：金屬如Hg、熒光物質(zhì)如F2TC、半抗原如地高辛、生物素、酶類如辣根過氧化物酶（HRP)、半乳糖苷酶或堿性磷酸酶（AKP)等，不同的標(biāo)記物，所標(biāo)記探針的方法及檢測方法也各異。
核酸探針的常用酶促標(biāo)記技術(shù)有：缺口平移；DNA快速末端標(biāo)記；用T4多核苷酸酶標(biāo)記DNa5"末端，隨引物延伸；聚合酶鏈反應(yīng)。
核酸探針的非放射性標(biāo)記技術(shù)有：光促生物素標(biāo)記核酸、酶促生物素標(biāo)記核酸、寡核苷酸的生物素末端標(biāo)記、酶標(biāo)DNA、酶標(biāo)寡核苷酸、DNA半抗原標(biāo)記。
隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，新的核酸分子雜交技術(shù)不斷出現(xiàn)和完善，核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸鏈游離在溶液中，固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。
在固相雜交中，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復(fù)性等優(yōu)點，所以比較常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。
液相雜交是一種研究最早且操作簡便的雜交類型，由于液相雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高，所以不如固相雜交那樣普遍。近幾年由于雜交檢測技術(shù)的不斷改進，商業(yè)性基因探針診斷盒的實際應(yīng)用，推動了液相雜交技術(shù)的迅速發(fā)展，下面對固相雜交和液相雜交分別進行介紹。
（一)固相膜核酸分子雜交方法。
固相核酸雜交多是在膜上進行，因此，以下主要介紹固相膜的核酸分子雜交方法。
1．DNA的變性解鏈?zhǔn)请s交成功的關(guān)鍵,Southern印跡雜交時DNA在凝膠中變性,變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/L NaOH中1小時，然后用數(shù)倍體積的1mol/L Tris-HCl （pH8.0)和1.5mol/L NaCl溶液中和1小時。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強酸會使核酸降解。堿變性可避免DNA的降解、熱變性要在低DNA濃度（100μg/ml)和低鹽濃度（0.1SSC 15mmol/L NaOH，1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0)下進行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml，加10mol/l NaOH使最終濃度為0.1mol/L（pH約12.8)，室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10mol/l HC1或5mol/L NaH2PO4調(diào)pH到7-8(亦可用堿變性后，調(diào)至中性，再加熱100℃后，調(diào)至中性，或只加熱100℃10min)。DNA變性可用OD260增加（約30-40%)來檢測，變性DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰溶保存。
2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定。硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45um)先在蒸餾水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min～2h，涼干，DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后再在80℃真空干燥2h。
3．預(yù)雜交。濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米膜加0.2ml預(yù)熱至60℃的預(yù)雜交液（6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚精DNA)。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調(diào)濃度至10μg/ml，用前放100℃水溶液中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，用封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68℃水浴中保溫3-12h，當(dāng)預(yù)雜交液溫度升至68℃時，在濾膜表面常會形成水氣泡，輕輕晃動袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點對于保證濾膜表面充分浸潤預(yù)雜交液很重要。
4．雜交�！乃≈腥〕鏊芰洗�，用剪刀剪開一角，盡可能擠凈預(yù)雜交液，用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好足量的液體保持濾膜濕潤（50ul/cm2)。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/L EDTA，變性的標(biāo)記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴(yán)密封口。雜交反應(yīng)在68℃水浴中進行，所需時間視探針和檢測靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定，一般為4-20h。
5．洗膜。取出塑料袋，用剪刀剪開，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤中,室溫下漂洗5min,再將濾膜移入2×SSC和0.1% SDS中,室溫下洗滌15分鐘(輕輕搖動),然后將濾膜移入0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃輕輕搖動保溫2h，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。
洗脫的溫度一般應(yīng)控制在Tm值12℃以下，[Tm=69.3+0.41×(G+C)%]，雙鏈DNA的Tm值隨錯配堿基對數(shù)每增加1%而遞減1℃。
6．結(jié)果顯示。放射性測定方法，固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式，一是放射自顯影法、另一是液閃計數(shù)法，放射自顯影法比較簡單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中暴光數(shù)小時至數(shù)天，再顯影，定影即可。對于雜交信號較強的固相膜，用一塊增敏屏可顯著增強暴光強度。此外，為了減弱32P的放射，暴光通常在-20℃或-80℃下進行。液閃計數(shù)法主要用于斑點和狹縫雜交及為了比較兩個雜交信號的強弱等情形，方法是將完成雜交的膜在漂洗結(jié)束后剪成小塊（每份樣品1塊)，80℃真空干燥后裝閃爍瓶，加入2—5ml閃爍液，剪2-3塊無樣品作為本底對照，在液體閃爍計數(shù)器上自動計數(shù)，液體計數(shù)測定放射性強度也可以在放射自顯影之后進行。
（二)固相核酸分子雜交類型
1．菌落原位雜交（colony in situhybridization)。是將細(xì)菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出DNA，將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號、并與主平板上的菌落對位。
實驗步驟如下：
①將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。
②培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1-2mm大小的菌落。
③在一塊平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體，將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙上，菌落面在上，注意防止濾膜底面存有氣泡。
④5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl)浸濕的濾紙上，放置10min。
⑤將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L Tris-HClpH8.0)浸濕的濾紙上，放置10min，重復(fù)中和一次。
⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過的濾紙上，放置10min，SSPE配成20×貯備液：3.6mol/lNaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。
⑦將濾膜用濾紙吸干，80℃真空烘干2h。
2．斑點雜交（Dot blot)。是將被檢標(biāo)本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析。一張膜上可同時檢測多個樣品，為使點樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold)，如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時的膜就可以進行雜交。
（1)DNA斑點雜交：
①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。
②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。
③用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點樣于膜上,每個樣品一般點5μl(2~10μg DNA)。
④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/p>
（2)RNA斑點雜交：與上法類似，每個樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化)，方法是將RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛)，使RNA變性，然后取5-8μl點樣于處理好的濾膜上，烘干。
（3)完整細(xì)胞斑點雜交：應(yīng)用類似檢測細(xì)菌菌落的方法，可以對細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進行快速檢測，將整個細(xì)胞點到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養(yǎng)細(xì)胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點印跡法可以用于篩選大量標(biāo)本，因為它使細(xì)胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針，因為DNA純度不夠，會產(chǎn)生高本底。
3.Southern印跡雜交（Southern blot)。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。Southern印跡雜交的基本方法是將DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和和高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上、烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著，附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確立探針互補的每一條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多消化產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
（1)瓊脂糖凝膠電泳。利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消解片段（0.3～25kb)分離開，分離大分子DNA片段（800-12000bp)用低濃度瓊脂糖（0.7%)，分離小分子片段（500～1000bp)用高濃度瓊脂糖（1.0%)，300-5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠。根據(jù)分離樣品品質(zhì)，分離速度和分辨率要求的不同，可選用不同規(guī)格的電泳槽。
電泳時，同時將分子量標(biāo)記物加到旁邊孔中，便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過夜，電泳完畢，將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩沖液中染色30min，也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在灌膠前加入膠片中，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5，曝光20-40s。
（2)硝酸纖維素膜吸印。
[1]將膠片切成合適大小，切去右上角作為記號。
[2]將膠片放進盛有變性緩沖液（1.5mol/l NaCl,0.5mol/L NaOH)的盤中輕晃15min。
[3]換到中和緩沖液（1mol/l Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH)的盤中輕晃30min。
[4]裁一張硝酸纖維素膜、2-4張3mm濾紙和一些吸印紙（可用衛(wèi)生紙)，都與膠的大小相同（硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大，否則易形成旁路)。先將硝酸纖維素膜浸到水中，再放入10×SSC緩沖液,接觸膠和硝酸纖維素膜時都要戴手套操作。
[5]平盤上放一塊比膠大的平板上面鋪一張3mm濾紙,起燈蕊作用,盤中加入少量10×SSC緩沖液（2.5cm厚)，不能沒過平板，使3mm濾紙充分飽和。
[6]將膠倒扣在3mm濾紙上。
[7]浸濕的硝酸纖維素膜在膠上，對齊。鋪膜時從一邊逐漸放下，防止產(chǎn)生氣泡，有氣泡時，可用吸管趕出，不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。
[8]膜上放一張3mm濾紙，不能與膠接觸。
[9]上面加吸印紙及重物（500g左右)。
[10]通過濾紙的燈芯作用，平盤中的緩沖液就會通過膠上移，從而將DNA吸印到膜上，及時更換浸濕的吸印紙，在室溫下轉(zhuǎn)印過夜。
[11]清除上面的東西。用鑷子將膜取出，在6×SSC中洗一下。
[12]自然干燥，80℃烤2h。
[13]這是的膜就可進行雜交，或室溫密封保存。
4．Northern印跡雜交（Northernblot)。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)，RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Western blot。Northern 印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2"-羥基基團。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后用低鹽緩沖液洗脫，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因為它會影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合。為測定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物切下、上色、照像，樣品膠則進行Northern轉(zhuǎn)印。標(biāo)記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脫色，在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化銀是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應(yīng)避免RNase的污染。
RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法。
<1>試劑：
10×MSE緩沖液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS)，pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/L EDTA pH8.0。
5×載樣緩沖液：50%甘油，1mmol/lEDTA，0.4%溴酚藍。
甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L)，應(yīng)在通風(fēng)柜中操作，pH高于4.0。
20×SSC；
去離子甲酰胺；
50mmol/LNaOH(含10mmol/L NaCl)；
0.1mol/LTris，pH7.5。
<2>步驟：
[1]40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml10×MSE緩沖液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。
[2]等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。
[3]使RNA變性（最多20μg)，RNA4.5ml,10×MSE緩沖液20ml，甲醛3.5ml，去離子甲酰胺10ml。
[4]55℃加熱15min，冰浴冷卻。
[5]加2ml5×載樣緩沖液。
[6]上樣、同時加RNA標(biāo)記物。
[7]60伏電泳過夜。
[8]取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。
[9]室溫下將膠浸到50mmol/l NaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉(zhuǎn)印。
[10]室溫下將膠浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使膠中和。
[11]20×SSC洗膠1h。
[12]20×SSC中過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。
[13]取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。
5．組織原位雜交（Tissue in situ hybridization)。組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進行雜交，而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，因此原位雜交可以確定探針互補序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。例如，對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示按規(guī)定序列的位置，對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；與細(xì)胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。
用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針操作的長度以100-400nt為宜，過長則雜交率減低。最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（16-30nt)能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長探針，因此，寡核苷酸探針和不對稱PCR標(biāo)記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交優(yōu)選探針。
探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等，放射性同位素中，3H和35S最為常用，3H標(biāo)記的探針半衰期長，成像分辨率高，便于定位，缺點是能量低，35S標(biāo)記探針活性較高，影像分辨率也較好，而32P能量過高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點。
原位雜交中，標(biāo)本的固定條件是影響雜交效率的重要因素。標(biāo)本組織蛋白質(zhì)的消化程度對探針進入細(xì)胞極為重要，去除蛋白質(zhì)的方法是，用0.2mol/l HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水。原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性、穩(wěn)定性上還需進一步完善和提高。
6，固相夾心雜交。Dunn等最早介紹了夾心雜交類型，Ranki等又作了進一步的改進，夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個主要的優(yōu)點：（1)樣品不需固定，對粗制樣品能做出可靠的檢測；（2)用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強，因為只有兩個雜交物都雜交才能產(chǎn)生可檢測的信號。
固相夾心法雜交需要兩個靠近而又互相重疊的探針，一個做固相吸附探針，另一個作標(biāo)記檢測探針，樣品基因組內(nèi)核酸只有使這兩個探針緊密相連才能形成夾心結(jié)構(gòu)，需要注意的是兩探針必須分別亞克隆進入兩個分離的非同源載體內(nèi)，以避免產(chǎn)生高的本底信號。
夾心雜交法可用濾膜和小珠固定吸附探針，使用小珠可更好地進行標(biāo)準(zhǔn)化試驗和更容易對小量樣品進行操作。Dahlen等利用微孔板進行夾心雜交，可同時進行大量樣品檢測，他們先吸附DNA探針加到凹板中，然后用紫外線照射使其固定到塑料板上，用微孔板進行夾心雜交還可直接用于PCR技術(shù)。應(yīng)用光敏生物素標(biāo)記探針，檢測PCR產(chǎn)物的敏感性和用32P標(biāo)記探針（3×108cpm/μg)作16h放射自顯影的Southern雜交的敏感性一樣。用微孔板雜交的其它優(yōu)點還有可同時操作多份樣品，加樣、漂洗和讀結(jié)果等步驟可以自動化。
7． 其它雜交類型
（1)固化探針雜交。該法較少使用，原理是使未標(biāo)記固化探針通過雜交與靶RNA或DNA結(jié)合，漂洗后，用酶標(biāo)抗DNA：RNA抗體或抗DNA：DNA抗體與雜交物結(jié)合，將乳膠顆粒收集，吸附到膜上后漂洗、加入底物顯色并進行測定，探針濃度為2μg/ml,80℃雜交，可在10-15min完成，檢測的敏感性為5×106靶序列。
（2)反向雜交：這個雜交類型是用標(biāo)記的樣品核酸與未標(biāo)記的固化探針DNA雜交，故稱為“反向雜交”。這種雜交方法的優(yōu)點是在一次雜交中，可同時檢測樣品中幾種核酸。這種雜交方式主要用于進行中的核轉(zhuǎn)錄試驗和多種病原微生物的檢測，前者是在轉(zhuǎn)錄過程中標(biāo)記RNA探針，后者可用光敏生物素制劑BPA標(biāo)記樣品核酸。
8．固相膜核酸雜交膜的選用。雜交膜是一種多孔、表面積很大的固相載體，核酸一旦固定在上面，就可用雜交法進行檢測。最常使用的膜是硝酸纖維素膜，用于放射性和非放射性標(biāo)記探針都很方便，產(chǎn)生的本底淺，與核酸結(jié)合的化學(xué)性不是很清楚，推測為非共價鍵結(jié)合，經(jīng)80℃烤干2h和雜交處理后，核酸仍不會脫落。硝酸纖維素膜的另一特點是只與蛋白有微弱非特異結(jié)合，這在使用同位素探針中尤為有用。硝酸纖維素膜的缺點是結(jié)合核酸能力的大小取決于轉(zhuǎn)印條件和高濃度鹽（>10×SSC),與小片核酸(<200bp)結(jié)合不牢，質(zhì)地脆，不易操作。
尼龍膜在某些方面比硝酸纖維素膜好，它的強度大，耐用，可與小至10bp的片段共價結(jié)合，在低離子濃度緩沖液等多種條件下，它們都可與DNA單鏈或RNA緊密結(jié)合，且多數(shù)膜不需烘烤。尼龍膜韌性好，可反復(fù)處理與雜交，而不丟失被檢標(biāo)本，它通過疏水鍵和離子鍵與核酸結(jié)合，結(jié)合力為350-500μg/cm2，比硝酸纖維素膜（80-100μg/cm2)強許多。尼龍膜的缺點是對蛋白有高親合力，不宜使用非同位素探針。
9．“噪音”的排除。“噪音”（noise)是固相膜雜交方法常遇到的問題，指標(biāo)記DNA結(jié)合到空白膜上的放射性計數(shù)，即本底。這個問題的克服一是使用高純度的核酸制品和充分嚴(yán)格的雜交條件，二是選擇合格的雜交反應(yīng)液和對膜進行處理。研究發(fā)現(xiàn)，隨著離子強度的增加，空白膜（未固定DNA對照膜)上的“噪音”水平增加，而在50%甲酰胺-6×SSC的雜交反應(yīng)液中“噪音”最低。目前，最常使用的消除噪音的方法是用Denhardt液與固定膜預(yù)保溫，這樣可以充分封閉膜上的多條非特異結(jié)合位點。
（三)液相核酸分子雜交類型
1、吸附雜交
（1)HAP吸附雜交，羥基磷灰石層析或吸附是液相雜交中最早使用的方法，在液相中雜交后，DNA：DNA雜交雙鏈在低鹽條件可特異地吸附到HAP上，通過離心使吸附有核酸雙鏈HAP沉淀，再用緩沖液離心漂洗幾次HAP，然后將HAP置于計數(shù)器上進行放射性計數(shù)。
（2)親和吸附雜交：生物素標(biāo)記DNA探針與溶液中過量的靶RNA雜交，雜交物吸附到�；H和素包被的固相支持物（如小球)上，用特異性抗DNA：RNA雜交物的酶標(biāo)單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應(yīng)，加入酶顯色底物。這個系統(tǒng)可快速（2h)檢測RNA。
（3)磁珠吸附雜交：Gen-Probe公司最近應(yīng)用丫啶翁酯（Acridinium ester)標(biāo)記DNA探針、這種試劑可用更敏感的化學(xué)方法來檢測，探針和靶雜交后，雜交物可特異地吸附在磁化的有孔小珠（陽離子磁化微球體)上，溶液中的磁性小珠可用磁鐵吸出，經(jīng)過簡單的漂洗步驟，吸附探針的小珠可用化學(xué)發(fā)光測定。
2、發(fā)光液相雜交
（1)能量的傳遞法。Heller等設(shè)計用兩個緊接的探針，一個探針的一端用化學(xué)發(fā)光基團（供體)標(biāo)記，另一個探針的一端用熒光物質(zhì)標(biāo)記，并且這兩個探針靠得很近，兩個靠得很近的探針用不同的物質(zhì)標(biāo)記（光發(fā)射標(biāo)記)。當(dāng)探針與特異的靶雜交后，這些標(biāo)記物靠得很近，一種標(biāo)記物發(fā)射的光被另一種標(biāo)記物吸收，并重新發(fā)出不同波長的光，調(diào)節(jié)檢測器使自動記錄第二次發(fā)射光的波長，只有在兩個探針分子靠得很近時，才能產(chǎn)生激發(fā)光，因此這種方法具有較好的特異性。
（2)丫啶翁酯標(biāo)記法。丫啶翁酯標(biāo)記探針與靶核酸雜交后，未雜交的標(biāo)記探針分子上的丫啶翁酯可以用專門的方法選擇性除去，所以雜交探針的化學(xué)發(fā)光是與靶核酸的量成比例的。該法的缺點是檢測的敏感度低（1ng的靶核酸)，僅適用于檢測擴增的靶序列，如rRNA或PCR擴增產(chǎn)物。
3、液相夾心雜交
（1)親和雜交 在靶核酸存在下，兩個探針與靶雜交，形成夾心結(jié)構(gòu)。雜交完成后，雜交物可移到新的管或凹孔中，在其中雜交物上的吸附探針可結(jié)合到固相支持物上，而雜交物上的檢測探針可產(chǎn)生檢測信號。用生物素標(biāo)記吸附探針，及125I標(biāo)記檢測探針。這個系統(tǒng)的敏感性可檢測出4×105靶分子，該試驗保持了固相夾心雜交的高度特異性。
（2)采用多組合探針和化學(xué)發(fā)光檢測 第一類探針是未標(biāo)記的檢測探針和液相吸附探針，它們有50個堿基長，其中含有30個細(xì)菌特異序列堿基和20個堿基的單鏈長尾；第二類探針是固相吸附探針，它可吸附在小珠或微孔板上。未標(biāo)記檢測探針的單鏈長尾用于結(jié)合擴增多體（標(biāo)記探針)，液相吸附探針和靶雜交物從溶液中分離并固定在小珠或微板上。典型的試驗可有25個不同的檢測探針和10個不同的吸附探針，第一個標(biāo)記檢測探針上附著很多酶（堿性磷酸酶或過氧化物酶)，可實現(xiàn)未標(biāo)記檢測探針的擴增，使用化學(xué)發(fā)光酶的底物比用顯色反應(yīng)酶的底物敏感。這個雜交方法用于乙肝病毒、沙眼衣原體、淋球菌以及質(zhì)粒抗性的檢測，敏感性能達到檢測5×104雙鏈DNA分子。
4、復(fù)性速率液相分子雜交
這個方法的原理是細(xì)菌等原生物的基因組DNA通常不包含重復(fù)順序，它們在液相中復(fù)性（雜交)時，同源DNA比異源DNA的復(fù)性速度要快，同源程度越多，復(fù)性速率和雜交率越快。利用這個特點，可以通過分光光度計直接測量變性DNA在一定條件下的復(fù)性速率，進而用理論推導(dǎo)的數(shù)學(xué)公式來計算DNA-DNA之間的雜交（結(jié)合)度。
聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechain reaction簡稱PCR)又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法，是基因擴增技術(shù)的一次重大革新�？蓪O微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或?qū)γ?0萬個細(xì)胞中僅含1個靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及遺傳學(xué)等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。由于PCR具有敏感性高、特異性強、快速、簡便等優(yōu)點，已在病原微生物學(xué)領(lǐng)域中顯示出巨大的應(yīng)用價值和廣闊的發(fā)展前景。
PCR技術(shù)是由Cetus公司和加利福利亞大學(xué)1985年聯(lián)合創(chuàng)造的，主要貢獻者為Kary B mulis和HeneryA、Erlich。該方法首先被應(yīng)用于人β-珠蛋白DNA的擴增及鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前診斷。自85年首次報道PCR方法以來，PCR被廣泛應(yīng)用于分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病及法醫(yī)判定和考古研究等多領(lǐng)域、并發(fā)揮了越來越大的作用。因而發(fā)明人Kary B、mulis獲1993年諾貝爾化學(xué)獎。
為了使PCR技術(shù)在臨床上迅速得以普及，我們對該技術(shù)的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技術(shù)變得簡單、微量化、不易發(fā)生污染，從而使PCR技術(shù)常規(guī)化成為可能。我們的方法迅速在全國各大醫(yī)院得到推廣。
PCR擴增DNA的原理是：先將含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對根據(jù)已知DNA序列由人工合成的與所擴增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴增的DNA片段，一般需20-30個堿基對，過少則難保持與DNA單鏈的結(jié)合。引物與互補DNA結(jié)合后，以靶DNA單鏈為模板，經(jīng)反鏈雜交復(fù)性（退火)，在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP)為原料按5"到3"方向?qū)⒁镅由臁⒆詣雍铣尚碌腄NA鏈、使DNA重新復(fù)制成雙鏈。然后又開始第二次循環(huán)擴增。引物在反應(yīng)中不僅起引導(dǎo)作用，而且起著特異性的限制擴增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補序列，并又可作為下一輪聚合反應(yīng)的模板。如此重復(fù)上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復(fù)性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環(huán)過程，使每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴增DNA產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴增。
PCR的擴增倍數(shù)Y=（1+E)n,這里Y是擴增量，n為PCR的循環(huán)次數(shù)。E為PCR循環(huán)擴增效率。設(shè)PCR擴增效率E為100%、循環(huán)次數(shù)n=25次，靶DNA將擴增到33554432個拷貝，即擴增3355萬倍：若E為80%、n=20、則擴增數(shù)量將下降到1408865拷貝，即擴增產(chǎn)物約丟失93%，若E=100%，n=20，則擴增數(shù)量減少1048576個拷貝，擴增產(chǎn)物約減少97%�？梢奝CR循環(huán)擴增效率及循環(huán)次數(shù)都對擴增數(shù)量有很大影響。PCR擴增屬于酶促反應(yīng)，所以，DNA擴增過程遵循酶促動力學(xué)原理。靶DNA片段的擴增最初表現(xiàn)為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當(dāng)引物—模板/DNA/聚合酶達到一定比值時，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，此時靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺效應(yīng)。PCR反應(yīng)達到平臺期的時間主要取決于反應(yīng)開始時樣品中的靶DNA的含量和擴增效率，起始模板量越多到達平臺期的時間就越短、擴增效率越高到達平臺期的時間也越短。另外酶的含量，dNTp 濃度，非特異性產(chǎn)物的擴增都對到達平臺期時間有影響。
（一)特異性高：首次報導(dǎo)的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymeraseI的Klenow大片段，其酶活性在90℃會變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入Klenow大片段，同時引物是在37℃延伸（聚合)易產(chǎn)生模板—引物之間的堿基錯配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時不被滅活，不必在每次循環(huán)擴增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應(yīng)，顯著地提高PCR產(chǎn)物的特異性，序列分析證明其擴增的DNA序列與原模板DNA一致。擴增過程中，單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。
（二)高度敏感：理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴增DNA十億倍以上，實際應(yīng)用已證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測。
（三)快速及無放射性：一般在2小時內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴增，加上用電泳分析。只需3-4小時便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗制品及總RNA均可作為反應(yīng)起始物，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發(fā)、細(xì)胞、活體組織等粗制的DNA的提取液來擴增檢測，省去費時繁雜的提純程序，擴增產(chǎn)物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無放射性易于推廣。
（四)簡便：擴增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規(guī)方法中須先進行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構(gòu)建一個內(nèi)切酶位點，擴增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應(yīng)酶切位點的載體中。
（五)可擴增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進行PCR擴增，即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經(jīng)PCR擴增1ng有242堿基對長度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難以將整段DNA大分子擴增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對外顯子的擴增并進行序列分析。
（一)試劑
（1)引物：決定擴增的特異性。根據(jù)檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生
物都有自己特異的引物。
（2)耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。
（3)10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。
（4)5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度最好用UV吸收法精確測定。現(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。
（5)DNA模板：用處理液將待測標(biāo)本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標(biāo)本中被檢測的DNA。
（二)操作程序
過去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進行循環(huán)擴增。具體如下：
（1)向一微量離心管中依次加入
DNA模板 102-105拷貝
引物 各1μmol/L
dNTP 各200μmol/L
10×PCR緩沖液1/10體積
ddH2O 補到終體積（終體積50μl-100μl)
混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實驗研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25μl，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。
（2)加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97℃變性10min。
（3)冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合�，F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。
（4)PCR的循環(huán)程序為：94℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。最后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。
PCR尚可用于組織標(biāo)本DNA的擴增。由于固定組織標(biāo)本的DNA常發(fā)生降解，就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術(shù)引入固定包埋組織內(nèi)DNA分析。他們先從組織標(biāo)本中提取DNA，再用PCR進行特異性的DNA擴增，應(yīng)用這種方法，他們成功地從保存30至40年之久的組織標(biāo)本DNA中擴增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA，操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對Impraim的方法進行了改進。他們將固定包埋的組織塊制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內(nèi)。加入400μl二甲苯脫脂，離心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去殘余二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應(yīng)基質(zhì)，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法進行DNA擴增。
在應(yīng)用PCR方法檢測RNA病毒時，首先應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進行擴增，因為PCR只能對DNA模板進行擴增，我們把這種RNA的PCR反應(yīng)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，簡稱RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過程叫做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成。
（一)模板核酸
PCR可以以DNA或RNA為模板進行核酸的體外擴增。不過RNA的擴增首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進行PCR循環(huán)。不同來源的核酸標(biāo)本必須經(jīng)處理后才能用于PCR的擴增，處理不當(dāng)或處理過程中DNA掉失都會導(dǎo)致PCR擴增失敗。采集標(biāo)本方法不當(dāng)，未能獲得所要檢測的靶DNA都會導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。但是如果待擴增標(biāo)本中模板DNA濃度太高也會導(dǎo)致擴增失敗。
（二)引物
PCR結(jié)果的特異性取決于引物的特異性，擴增產(chǎn)物的大小也是由特異引物限定的。因此，引物的設(shè)計與合成對PCR的成功與否起著決定性的作用。合成的引物必須經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC)純化。因為合成的引物中會有相當(dāng)數(shù)量的“錯誤序列”，其中包括不完整的序列和脫嘌呤產(chǎn)物以及可檢測到的堿基修飾的完整鏈和高分子量產(chǎn)物。這些序列可導(dǎo)致非特異擴增和信號強度的降低。因此，PCR所用引物質(zhì)量要高，且需純化。凍干引物于-20℃至少保存12-24個月，液體狀態(tài)于-20℃可保存6個月。引物不用時應(yīng)存于-20℃保存。
PCR反應(yīng)中引物的量也影響PCR擴增效果，當(dāng)PCR引物量太低，則產(chǎn)物量降低，會出現(xiàn)假陰性。引物濃度過高會促進引物的錯誤引導(dǎo)非特異產(chǎn)物合成，還會增加引物二聚體的形成。非特異產(chǎn)物和引物二聚體也是PCR反應(yīng)的底物，與靶序列競爭DNA聚合酶，dNTP底物，從而使靶序列的擴增量降低。一般認(rèn)為PCR反應(yīng)中引物的終濃度為0.2～1μmol/L為宜，但我們實驗發(fā)現(xiàn)，最適濃度遠遠低于此濃度。
（三)緩沖液
PCR反應(yīng)的緩沖液的目的是給Taq DNA聚合酶提供一個最適酶催反應(yīng)條件。目前最為常用的緩沖體系為10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一種雙極性離子緩沖液，20℃時其pKa值為8.3，△pKa值為-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在實際PCR中，pH變化于6.8-7.8之間。改變反應(yīng)液的緩沖能力，如將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9,有時會增加產(chǎn)量。
反應(yīng)混合液中50mmol/L以內(nèi)的KCl，pH8.9有利于引物的退火，50mmol/lNaCl或50 mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應(yīng)液中以NH+4代K+，其濃度為16.6mmol/L。反應(yīng)中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml)或明膠（0.01%)或Tween20（0.05% ～0.1%)有助于酶的穩(wěn)定，反應(yīng)中加入5mmol/l 的二硫蘇糖醇（DTT)也有類似作用，尤其在擴增長片段（此時延伸時間長)時，加入這些酶保護劑對PCR反應(yīng)是有利的。
（四)Mg2+
Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性，這是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它還影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，通常會導(dǎo)致非特異性擴增產(chǎn)物的累積。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp的磷酸基團均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實際濃度。因為Taq DNA聚合酶需要的是游離Mg2+。
（五)三磷酸脫氧核苷酸（dNTP)
四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP)是DNA合成的基本原料，PCR反應(yīng)中dNTP含量太低，PCR擴增產(chǎn)量太少、易出現(xiàn)假陰性。過高的dNTP濃度會導(dǎo)致聚合將其錯誤摻入（即所謂的“熱力背信”)，因此應(yīng)當(dāng)避免。一般認(rèn)為最適的dNTP濃度為50～200μmol/L。dNTP的質(zhì)量也直接影響PCR反應(yīng)的成敗。
（六)耐熱DNA聚合酶
PCR之所以能得到廣泛應(yīng)用，主要是因為Taq DNA聚合酶取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus（Taq)中分離出的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不僅簡化了PCR程序，也極大地增加了PCR特異性及PCR擴增效率。該酶的最適溫度很高（79℃)，使引物在高溫下進行退火和延伸，這樣便增加了反應(yīng)的總強度并減少了與錯配引物的延伸。在PCR反應(yīng)中，每100μl反應(yīng)液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳，酶的濃度太低會使擴增產(chǎn)物產(chǎn)量降低，如果酶的濃度太高則會出現(xiàn)非特異性擴增。Taq DNA聚合酶保存不當(dāng)而失活是PCR實驗失敗的常見原因。
（七)溫度循環(huán)參數(shù)
1．變性溫度與時間
PCR反應(yīng)中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產(chǎn)物雙鏈完全解開，才能有效的和引物結(jié)合。這種結(jié)合是PCR擴增的基礎(chǔ)。變性溫度越高，時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響TaqDNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應(yīng)中第一個循環(huán)變性最重要，需時間較長，因模板DNA的鏈比較長。
2．復(fù)性溫度與時間
變性溫度是PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復(fù)性越好，但是容易出現(xiàn)引物與靶DNA的錯配，增加非特異性結(jié)合，溫度太高不利于復(fù)性，大多數(shù)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度在55℃左右。確定了復(fù)性溫度后，復(fù)性時間并不是關(guān)鍵因素。但復(fù)性時間太長會增加非特異的復(fù)性。
3．延伸溫度與時間
引物延伸溫度一般為72℃。這個溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性，又考慮到引物和靶基因的結(jié)合。不合適的延伸溫度不僅會影響擴增產(chǎn)物的特異性，也會影響其產(chǎn)量，72℃時，核苷酸的合成速度為35-100個核苷酸/S，這取決于緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)。72℃延伸1min對于長達2kb的擴增片段是足夠的。然而，延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對很低濃度底物的擴增，延伸時間要長些。
4．循環(huán)數(shù)：
循環(huán)數(shù)決定著擴增的產(chǎn)量。在其它參數(shù)都已優(yōu)化條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時、要增加循環(huán)次數(shù)。另外，酶活性不好，或量不足時也要增加循環(huán)次數(shù)、以便達到有效的擴增量。
在將Taq DNA聚合酶引入PCR反應(yīng)，并使之達到自動化之后，PCR反應(yīng)已變得十分的簡單了。但是PCR樣品的采集及制備卻并非同樣簡單，而且，許多PCR的失敗都?xì)w因于標(biāo)本的制備不當(dāng)。用于PCR的標(biāo)本必須經(jīng)適當(dāng)處理后才能使用，因為標(biāo)本中的許多雜質(zhì)能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外，處理標(biāo)本可使待擴增DNA暴露，能與引物復(fù)性。關(guān)于PCR標(biāo)本制備各種專業(yè)書中介紹了許多，我們實驗發(fā)現(xiàn)操作復(fù)雜、不慎便容易造成污染，且不實用�，F(xiàn)介紹一種簡單快速的處理方法即3%異硫氰酸胍和待檢標(biāo)本混合100℃，10min，離心取上清作為PCR模板即可。
所有實驗結(jié)果都有成功或失敗，實驗的失敗可能是應(yīng)該出結(jié)果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結(jié)果而出了結(jié)果我們把它稱為假陽性。PCR實驗中最常見的問題就是假陰性和假陽性問題。
（一)假陰性：出現(xiàn)假陰性結(jié)果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設(shè)計不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠。所以在實驗中出現(xiàn)假陰性失敗時，首先在原來擴增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環(huán)，一般都會獲得成功。如果沒有成功應(yīng)檢查PCR擴增儀的溫度是否準(zhǔn)確，采集標(biāo)本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時，要注意用活力高質(zhì)量好的酶。同時在提取PCR模板時，應(yīng)特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚、氯仿)的存在。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機試劑的污染。PCR擴增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補，尤其是要絕對保證引物的3′端與靶基因的互補。對變異較大的擴增對象，宜采用巢式（Nested)PCR或double PCR。在進行PCR操作時應(yīng)注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應(yīng)的各溫度點的設(shè)置要合理。
（二)假陽性：PCR結(jié)果的假陽性是對被檢測標(biāo)本而言，而反應(yīng)系統(tǒng)中所擴增的產(chǎn)物是真實的。因為PCR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成大量擴增，而造成結(jié)果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標(biāo)本間的交叉污染和擴增子的污染。出現(xiàn)假陽性結(jié)果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。
PCR擴增DNA片段只是一個重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的，根據(jù)研究對象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產(chǎn)物的大小，有助于擴增產(chǎn)物的鑒定，點雜交除可鑒定擴增產(chǎn)物外，還有助于產(chǎn)物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴增產(chǎn)物中鑒定出特異產(chǎn)物的大小，增加檢測的特異性與敏感性，最近發(fā)展的一系列產(chǎn)物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等)均有助于產(chǎn)物的精確分析。
（一)凝膠電泳分析法
PCR產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以前者最常用，通過電泳可以判斷擴增產(chǎn)物的大小。在臨床檢測中，僅通過凝膠電泳判斷擴增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內(nèi)溶解，稍冷后倒入電泳槽。
電泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去離子水漂洗2次，每次15min，于UV燈下觀察結(jié)果并拍照。
凝膠電泳不僅可以鑒定產(chǎn)物的大小，檢測擴增的情況，還可以用來純化擴增產(chǎn)物。
（二)點雜交
當(dāng)擴增產(chǎn)物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的探針雜交。點雜交還有助于檢測突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對人們認(rèn)識某些疾病與基因變異的關(guān)系起了很大的作用。但是，由于同位素不穩(wěn)定和放射性危害，不能常規(guī)用于臨床或法醫(yī)檢驗，用非放射性物質(zhì)（生物素、熒光素和地高辛等)標(biāo)記的寡核苷酸探針分析PCR產(chǎn)物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標(biāo)記物質(zhì)穩(wěn)定性高，使用方便、安全、檢測速度快。
（三)微孔板夾心雜交法
該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異雜交使產(chǎn)物間接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果，該法需要兩個雜交過程來檢測一個產(chǎn)物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV的檢測，其敏感度可達5個HBvDNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當(dāng)。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標(biāo)記探針的危害，顯色反應(yīng)類似于臨床常規(guī)應(yīng)用的ELISA,適于臨床實驗室常規(guī)應(yīng)用。
（四)PCR-ELISA法
本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測。因為5"端修飾后仍可進行常規(guī)PCR擴增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產(chǎn)物便于檢測。
