動(dòng)脈粥樣硬化:第三節(jié)　蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

蛋白質(zhì)溶液濃度測(cè)定方法有多種，下述幾種方法可供選用。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定，往往用于計(jì)算純化方法的回收率的重要方法。

一、雙縮脲法

雙縮脲法是第一個(gè)用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法，至令仍廣泛采用。在需www.med126.com要快速，但不很準(zhǔn)確的測(cè)定中，常用此法。硫銨不干擾顯色，這對(duì)蛋白質(zhì)提純的早期價(jià)段是非常有利的。雙縮脲法的原理是Cu²⁺與蛋白質(zhì)的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍(lán)色絡(luò)合物，此物在540nm波長處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白質(zhì)溶液測(cè)定。干擾物有硫醇，以及具有肽性質(zhì)緩沖液，如Tris、Good緩沖液等。可用沉淀法除去干擾物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質(zhì)，然后棄去上清液，再用已知體積的1m NaOH溶解沉淀的蛋白質(zhì)進(jìn)行m.f1411.cn/yishi/定量測(cè)定。

二、Lowry法

此法是雙縮脲法的進(jìn)一步發(fā)展。他的第一步就是雙縮脲反應(yīng)，即Cu⁺⁺與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡(luò)合物，然后這個(gè)絡(luò)合物還原磷鉬磷-磷鎢酸試劑（福林-酚試劑)，結(jié)果得到深藍(lán)色物。此法比雙縮脲法靈敏得多，適合于測(cè)定20mg/L～400mg/L含量的蛋白質(zhì)溶液。其干擾物質(zhì)與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大，硫醇和許多其他物質(zhì)的存在會(huì)使結(jié)果嚴(yán)重偏差。另外要注意的是，加入福林試劑時(shí)要特別小心，試劑只在酸性pH環(huán)境中才穩(wěn)定，上述提到的還原反應(yīng)只有在pH10時(shí)才發(fā)生，因此，福林試劑加入到堿性的Cu^2+-蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立刻攪拌，以使磷鉬酸-磷鎢酸試劑在未被破壞之前能有效地被Cu2^+-蛋白質(zhì)絡(luò)合物所還原。

三、紫外吸收法

大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm波長處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故，因此，利用這個(gè)特異性吸收，可以計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。如果沒有干擾物質(zhì)的存在，在280nm處的吸收可用于測(cè)定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白質(zhì)溶液。部分純化的蛋白質(zhì)常含有核酸，核酸在260nm波長處有最大吸收。有核酸時(shí)，所測(cè)得的蛋白質(zhì)濃度必須作適當(dāng)校正，一般按下述公式粗略計(jì)算：

是蛋白質(zhì)溶液在280nm波長處（光程1厘米)測(cè)得的光密度值。

是蛋白質(zhì)溶液在260nm小波長處（光程1厘米)處所測(cè)得的光密度值。

此方程是從烯醇酶（在酵母核酸存在時(shí))得出來的。因此，對(duì)其他蛋白質(zhì)和其他核酸不一定適用。由于各種蛋白質(zhì)所含芳香族氨基酸的量不同，因此，濃度為0.1%的各種蛋白質(zhì)在280nm處的消光系數(shù)（

)在0.5～2.5之間變化。

所有的蛋白質(zhì)在230nm以下都有強(qiáng)吸收。例如，牛血清白蛋白的α^0.1%在225nm和215nm處分別為5.0和11.7，而在280nm處測(cè)為0.58。在230nm以下的強(qiáng)吸收是由于肽鍵的存在，因此，此值對(duì)所有的蛋白質(zhì)都是一樣的。從215nm和225nm處的光密度之差可用于測(cè)定濃度為10μl/ml～100μl/ml的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度可以近似地由下式得到：

光密度之差求

得，這一公式是減去溶液中非蛋白質(zhì)成分產(chǎn)生的誤差。但是，蛋白質(zhì)之間的分子量差異比較大，因此，在比較幾種蛋白質(zhì)含量時(shí)，必須作適當(dāng)?shù)男Ｕ�。由于蛋白質(zhì)的吸收峰常因pH改變而變化，所以在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，必須與樣品條件一致。

（吳翠華　賀小玲　周新)