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1.2 方法
1.2.1 模型復(fù)制方法[1] 將 CCl4與橄欖油以4∶6(體積比)配成 40%油劑，首劑按0.5ml/100g體重腹腔注射，以后按 0.3ml/100 g體重腹腔注射，2次/周，第4周末，大鼠中期肝纖維化形成并開始治療，治療期間繼續(xù)CCl4腹腔注射，以維持病因刺激至第12周末。
1.2.2 分組 造模過程共死亡8只大鼠，將余下的132只大鼠肝纖維化模型隨機分為加味桃核承氣湯低劑量組27只、加味桃核承氣湯中劑量組27只、加味桃核承氣湯高劑量組26只、秋水仙堿組26只、模型對照組26只;造模前設(shè)有正常對照組10只。共6組。
1.2.3 給藥方法 于第4周末開始給藥。加味桃核承氣湯低、中、高劑量組分別按每100g體重 0.25ml、 0.5ml、1.0ml的劑量灌胃給藥;秋水仙堿組按每kg體重0.1mg的劑量，秋水仙堿用生理鹽水溶解后灌胃;模型對照組、正常對照組以同體積生理鹽水灌胃。療程均為每天1次，連用8周。
1.2.4 標本的提取方法 治療8周后，股動脈取血作肝功能指標檢測;取肝組織用10%福爾馬林固定，用作組織病理學(xué)觀察。
1.2.5 觀察指標 (1)一般情況：觀察大鼠精神、食欲、毛色、二便及舌質(zhì)的變化，觀察肝臟質(zhì)地。(2)肝功能指標血清ALT、AST測定：日本島津7200型全自動生化分析儀測定。(3)肝組織病理學(xué)觀察：肝組織經(jīng)石蠟包埋、切片，作HE染色、苦味酸-天狼紅膠原染色，觀察肝細胞變性、纖維組織增生情況。按2000年全國肝炎防治會議制定的標準(2000標準)觀察肝纖維化變化情況[2]，再按肝纖維化組織半定量計分系統(tǒng)(SSS)計分[3]。(4)肝組織TGFβ1的蛋白表達，采用免疫組織化學(xué)染色法。肝組織經(jīng)石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、乙醇水化;PBS液洗5min，共3次;3%H2O2室溫孵育30min;PBS液洗3次，5min/次;加抗TGFβ1抗體，濕盒內(nèi)置37℃孵箱內(nèi)2h;PBS液洗3次，5min/次;加二抗，37℃孵箱內(nèi)置1h;PBS液洗3次，5min/次;DAB顯色10min;流水終止反應(yīng)3min;蘇木素復(fù)染3min;流水洗1min;1%鹽酸酒精分化;流水藍化10min;梯度酒精脫水5min;中性樹膠封片。檢測TGFβ1蛋白表達的半定量方法：用彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)在低倍鏡(100×)下計算每視野棕黃色陽性面積占視野總面積百分比(%)。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。
2 結(jié)果
2.1 一般情況 模型對照組大鼠疲軟、不喜活動、飲食減少、皮毛雜亂、便溏、明顯消瘦、舌質(zhì)紫暗、7只出現(xiàn)腹水;秋水仙堿組精神狀態(tài)及活動情況一般，有2只大鼠出現(xiàn)腹水;高、中、低治療組精神狀態(tài)相對較好，皮毛有光澤，無腹水。肝臟質(zhì)地：模型對照組肝臟顏色灰暗，質(zhì)硬，腫脹，呈顆粒狀;各治療組情況較好，肝臟質(zhì)地較軟，邊緣規(guī)則，顏色較前紅潤，無顆粒狀改變醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站m.f1411.cn。
2.2 對肝纖維化大鼠ALT、AST的影響 見表1。
2.3 肝纖維化 模型對照組天狼紅染色可見匯管區(qū)和小葉間有大量粗大增生的膠原纖維，大量膠原沉積，相互連接的纖維隔將肝小葉重新分割，形成結(jié)節(jié)樣的假小葉;加味桃核承氣湯高、中劑量組天狼紅染色可見匯管區(qū)有很細很少的纖維隔，且尚未連接;秋水仙堿組有膠原沉積，小葉間有細纖維隔相連，但未見結(jié)節(jié)樣的假小葉。加味桃核承氣湯高、中劑量治療組及秋水仙堿組的肝纖維化SSS計分較模型對照組減少，加味桃核承氣湯高、中劑量治療組SSS計分低于秋水仙堿組。見表1。表1 對肝纖維化大鼠肝功能及SSS計分結(jié)果的影響與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型對照組比較，^P<0.05，^^P<0.01;與秋水仙堿組比較△P<0.05
2.4 肝組織TGFβ1的表達 在CCl4肝纖維化模型大鼠肝組織中TGFβ1表達廣泛且特點相似，在纖維間隔、肝竇、纖維間隔周圍的肝細胞、匯管區(qū)和中央靜脈等均可見表達，顯著高于正常對照組;加味桃核承氣湯高、中、低劑量組及秋水仙堿組的TGFβ1的表達水平均低于模型對照組。見表2及圖1～6。表2 加味桃核承氣湯對肝纖維化大鼠TGFβ1表達的影響
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