醫(yī)學論文范文:rAAV2/1�睞crp30對動脈粥樣硬化的GK大鼠NF�拨蔅及黏附分子的影響

脂聯素(adiponectin, APN, Acrp30)是由脂肪細胞分泌的一種蛋白質。研究證實脂聯素與胰島素抵抗密切相關，具有抗動脈粥樣硬化形成、抗炎癥和損傷后抗內膜增生的特性。因此，脂聯素與糖尿病心血管疾病密切相關，脂聯素水平的下降是糖尿病及其心血管并發(fā)癥的一個重要的獨立危險因素[3��4]，補充脂聯素可能是對上述疾病的一種新的治療手段。轉基因技術是補充脂聯素的一種方法。在本課題前期研究中，我們課題組已成功構建rAAV2/1�睞crp30載體[4]和糖尿病動脈粥樣硬化模型[5]。在本次研究中，我們將探討rAAV2/1�睞crp30對2型糖尿病動脈硬化模型大鼠黏附分子及NF�拨蔅的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6月齡雄性SPF級自發(fā)性糖尿病GK大鼠90只[購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，質量合格號：SCXK(滬)2006��0003]。適應性飼養(yǎng)1周后，選取隨機血糖值(羅氏全血葡萄糖測試儀)在11.1mmol/L以上的GK大鼠88只納入本實驗。按1只/籠飼養(yǎng)于獨立通氣籠具(IVC)系統(tǒng)內。溫度(22±1)℃，濕度59%～61%，每天光照與黑暗時間各12h。所用籠具、飼料、墊料、飲水均高壓滅菌(15磅，20min)。實驗期間的灌胃、換水、添加飼料等操作均在超凈工作臺內進行，由專人管理。

1.2 試劑和儀器 Rneasy Mini Kit：QIAGEN;ReverTra Ace�拨联睺M，First Strand cDNA Synthesis Kit：TOYOBO;Taq DNA聚合酶：美國Fermentas公司;dNTPs：美國Fermentas公司，DNA Marker DL 2000：TaKaRa;大鼠ICAM��1 ELISA試劑盒：美國ADL公司;瓊脂糖：西班牙進口分裝;rAAV2/1�睞crp30：本課題組合成;空載腺相關病毒：本元正陽生物公司;H��7500透射電子顯微鏡：日本日立電子公司;AL��104電子天平：Mettler�睺oledo公司;超凈臺：BOXUN公司;PCR儀：Biometra;UNOⅡ水平電泳槽：北京君意東方儀器公司，JY�睸PC;電泳儀：北京鼎國生物技術發(fā)展中心，DG�并箅p穩(wěn)數顯電泳儀;凝膠成像系統(tǒng)：柯達紫外顯相系統(tǒng)400W像素;酶標分光儀：Quant Instuments inc公司。

1.3 動物建模 大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機選取血糖值(怡成全血葡萄糖測試儀)在11.1mmol/L以上的GK大鼠，同時喂飼高脂飼料(普通飼料87.5%、精煉豬油10%、膽固醇2.0%、豬膽鹽0.3%，丙基硫氧嘧啶0.2%)。模型組在喂飼高脂飼料的基礎上加用10mg/(kg·d)一氧化氮合成酶(nitric oxide svnthase, NOS)抑制劑—N�蚕趸��睱��精氨酸甲酯(L�睳AME)灌胃。同時，Wistar組喂飼普通飼料，生理鹽水灌胃，連續(xù)8周[5]。

1.4 實驗動物分組及處理 除去造模失敗及死亡大鼠，將30只動脈硬化GK鼠納入本實驗。隨機數字法分為以下三個處理組：①模型1組(model group one, M1)：后肢肌肉注射生理鹽水;②模型2組(model group two, M2)：后肢肌肉注射空病毒rAAV2/1;③治療組(treatment group, T)：后肢肌肉注射rAAV2/1�睞crp30：1×1012mg/L。

1.5 標本采集 光鏡和掃描電鏡樣本制備及觀察。

治療階段：實驗第0，8周，各組大鼠在禁食的基礎上，眶靜脈采血一次約2mL，低速離心機3300r/min離心后分離出血清。實驗第8周，在禁食的基礎上處死所有大鼠，用100mL/L的水合氯醛按3mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。迅速打開胸腔，腹主動脈采血。低速離心機3300r/min離心后分離出血清，用于測定血脂及sICAM��1。將灌流針從心尖部位插入左心室至主動脈，快速灌注100mL生理鹽水，再用500mL生理鹽水經心臟反復灌洗至發(fā)白，灌畢約30min，取主動脈弓下段2～3cm主動脈，用預冷的生理鹽水清洗，去除周圍結締組織，于-70℃冰箱保存。

1.6 指標測定 ELISA法測血清sICAM��1，sVCAM��1。試劑盒購自美國ADL公司。RT�睵CR測主動脈NF�拨蔅p65 mRNA。

1.7 統(tǒng)計學方法 各實驗獨立重復3次以上，重復性好。利用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數值皆以±s表示。多樣本均數間采用單因數方差分析(one�瞱ay ANOVA)，方差不齊的采用TamhanecsT2統(tǒng)計方法檢驗，P<0.05表示差異有顯著性意義。

2 結 果

rAAV2/1�睞crp30對模型大鼠血清sICAM��1、sVCAM��1、主動脈NF�拨蔅p65 mRNA水平的影響顯示：治療8周后，T組sICAM��1，sVCAM��1水平較M1組及M2組明顯下降(P<0.05，見表1、表2)，T組治療前(0周)與治療后(8周)相比，sICAM��1、sVCAM��1水平明顯下降(P<0.05，表1、表2)。治療組T主動脈處NF�拨蔅p65 mRNA表達水平較M1組及M2組低(P<0.05，表3、圖1)。表1 各組大鼠血清可溶性細胞間黏附分子變化表2 各組大鼠血清可溶性血管細胞間黏附分子的變化表3 各組大鼠主動脈NF�拨蔅p65 mRNA表達水平的半定量比較

3 討 論

脂聯素是由脂肪細胞分泌的一種蛋白質。研究證實脂聯素與胰島素抵抗密切相關，具有抗動脈粥樣硬化形成、抗炎癥和損傷后抗內膜增生的特性。已有大量研究把脂聯素作為抗動脈粥樣硬化及抗炎的治療手段，將表達人脂聯素的腺病毒轉染給載脂蛋白E缺乏小鼠，14d后動脈竇處的動脈粥樣斑塊與對照組比較減小約30%，免疫組織化學顯示腺病毒攜帶的脂聯素轉移入粥樣硬化斑塊脂紋的泡沫細胞內[6��7]。

A, M: marker; 1: system materials for internal reference (GAPDH); 2: model group one (M1); 3: model group two (M2); 4: treatment group (T)脂聯素基因敲除的大鼠出現血管炎癥反應，導致血管機械性損傷，新生血管壁增厚，血管平滑肌增生。此時如果補充脂聯素，那么這些情況就會改善[6]。脂聯素可以抑制血管內皮細胞炎癥及黏附，抑制泡沫細胞的形成，抑制血管平滑肌的增殖，抑制炎性因子的產生等，在動脈粥樣硬化形成的各個階段發(fā)揮其保護作用醫(yī).學全.在.線網站m.f1411.cn。

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