醫(yī)學(xué)論文范文:雌激素及拮抗劑三苯氧胺對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長的影響

1.2 試劑與儀器 去酚紅DMEM/F��12 細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Hyclone 公司);DMEM/F��12 細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Hyclone公司);胎牛血清(FBS，美國Invitrogen公司);17β�泊贫�醇(17β�瞖strodiol，E2，美國Sigma公司)和TAM(美國Sigma公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，美國Sigma公司);96孔板(COSAR公司);PBS液(自行配制);RNA酶(市售);碘化丙啶(PI，市售);流式細(xì)胞儀(美國Bectondickinson公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含5%FBS的DMEM/F��12培養(yǎng)液，在37℃、95%空氣、5%二氧化碳的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，傳代三代以上。

1.3.2 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC��1B細(xì)胞生長情況：細(xì)胞消化后以2×104/ml濃度接種入96孔板，每孔150 μl。隔日換液。用含1%活性炭處理的胎牛血清的去酚紅DMEM/F��12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分組處理：E2(10-8M)組、TAM (10-7M )組、對照組，分別刺激24、48、72、96 h。每組8個(gè)復(fù)孔。3組按相應(yīng)時(shí)間用MTT法測定細(xì)胞生長情況，選擇492 nm波長測定吸光值。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定細(xì)胞周期：細(xì)胞換用無酚紅DMEM/F��12培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后分別加入E2(10-8M)、TAM (10-7M)及培養(yǎng)液刺激24、48、72、96 h。3組細(xì)胞用胰酶/EDTA消化后，制成活的單細(xì)胞懸液，室溫1 000 r/min離心5 min，吸去上清。加入0.01 mmol/L PBS洗兩遍，鏡下計(jì)數(shù)每組細(xì)胞總數(shù)均在(2～5)×106個(gè)。離心去除PBS，加入預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃過夜。14 000 g短時(shí)離心沉淀細(xì)胞，棄去固定液， PBS洗1次。離心去除PBS，加入RNA酶(100 μg/ml)，室溫30 min酶切RNA。PI溶液(終濃度為100 μg/ml)1 ml攪拌，4℃避光20～30 min。流式細(xì)胞儀檢測：以激發(fā)波長488 nm測定。采用S 期細(xì)胞比率(SPF)作為分析指標(biāo)：SPF(%)=[S/(G0G1+S+G2M)]×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間差異采用One Way ANOVA進(jìn)行處理，F(xiàn)CM結(jié)果采用描述性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測定藥物刺激不同時(shí)限HEC��1B細(xì)胞生長情況

2.1.1 E2作用HE��1B細(xì)胞不同時(shí)間吸光值比較：加入E2后24 h和48 h，E2組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，加藥后72 h和96 h，E2顯著刺激HEC��1B細(xì)胞生長(P<0.05)。見表1。表1 E2作用不同時(shí)間的吸光值比較

2.1.2 TAM作用HEC��1B細(xì)胞不同時(shí)間吸光值比較：加入TAM后24 h和48 h，TAM組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，加藥后72 h和96 h，明顯刺激HEC��1B細(xì)胞生長，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。表2 TAM作用不同時(shí)間吸光值比較

2.2 應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析不同藥物對細(xì)胞周期的影響 HEC��1B細(xì)胞加入E2刺激后，S期細(xì)胞比率在加藥72 h和96 h逐漸高于對照組，細(xì)胞增殖活躍。TAM作用細(xì)胞后，SPF值在24 h無明顯增高，48 h開始有升高趨勢，SPF在加藥72 h和96 h均明顯高于對照組。見表3。表3 3組藥物刺激不同時(shí)間SPF值比較

3 討論

3.1 雌激素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的影響 70%～80%子宮內(nèi)膜癌為激素依賴型腫瘤，其發(fā)生與子宮內(nèi)膜長期接受雌激素的頻繁刺激而缺乏孕酮拮抗有關(guān)。多數(shù)子宮內(nèi)膜癌患者具有高雌激素狀態(tài)，證實(shí)了腫瘤對體內(nèi)高雌激素的依賴性[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雌激素可明顯促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌HEC��1B細(xì)胞的生長，能使S期細(xì)胞比例明顯升高，促進(jìn)細(xì)胞的分裂、增殖，減少細(xì)胞凋亡。子宮局部血流內(nèi)高雌激素血癥是引起子宮內(nèi)膜增生的關(guān)鍵因素，認(rèn)為高濃度的E2水平對二倍體內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用。國外學(xué)者對子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系HEC��1A、ECC��1和PRAB��36進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)17β�泊贫�醇具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長作用，其作用與不同的雌激素受體亞型有關(guān)[3,4]。雌激素的作用途徑[5]主要是通過與細(xì)胞內(nèi)特異性受體ERα、ERβ在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞核內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)合成增加，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增生�；蚴峭ㄟ^細(xì)胞膜的非基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)生快速效應(yīng)，其具體機(jī)制尚不明確。張麗麗等[6]研究認(rèn)為，17β�泊贫�醇可以通過細(xì)胞膜受體對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的快速激活效應(yīng)，引起細(xì)胞生物學(xué)變化醫(yī).學(xué).全.在.線m.f1411.cn。

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