大黃素對(duì)模擬冷缺血再灌注后肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及細(xì)胞凋亡的影響

1 材料與方法

1.1 材料

肝細(xì)胞株HL��7702由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)提供;RPMI 1640培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清由杭州四季青生物工程研究所提供;混合氣體95% N2��4% CO2��1% O2由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院后勤中心提供;大黃素、Annexinⅴ凋亡試劑盒為美國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品。AO/EB凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。Fluo��3/AM鈣離子熒光探針為美國(guó)Biotium公司產(chǎn)品;LDH檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。流式細(xì)胞儀型號(hào)FACSCabuliburTM USA，Olympus熒光顯微鏡型號(hào)BX51TR��32FB3�睧01 Japan。

1.2 冷缺血再灌注損傷模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

模擬冷缺血再灌注模型參照文獻(xiàn)[6]的方法并加以改進(jìn)：①肝細(xì)胞HL��7702體外培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，等量均勻接種于6孔板或25mL培養(yǎng)瓶中，給予大黃素干預(yù)，按100、10、1μmol/L分為高、中、低濃度組和對(duì)照組(未予大黃素干預(yù))，培養(yǎng)24h準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn);②模擬缺血：將培養(yǎng)液吸棄，等體積加入模擬缺血溶液(NaCl 98.5mmol/L、KCl 10mmol/L、NaH2PO4 0.9mmol/L、NaHCO3 6.0mmol/L、CaCl2 1.8mmol/L、MgSO4 1.2mmol/L、乳酸鈉40mmol/L、HEPES 20mmol/L，pH 6.8，4℃)，并給予大黃素干預(yù)。再將培養(yǎng)容器放入缺氧培養(yǎng)裝置中，充入混合氣體(95% N2��4% CO2��1% O2)，待氧分壓≤1%時(shí)，同時(shí)關(guān)閉進(jìn)氣口與出氣口，放入4℃冰箱保存8h;③模擬再灌注：取出培養(yǎng)容器，吸棄模擬缺血溶液，等體積加入模擬再灌注液(NaCl 129.5mmol/L、KCl 5.0mmol/L、NaH2 PO4 0.9mmol/L、NaHCO3 20mmol/L、CaCl2 1.8mmol/L、MgSO4 1.2mmol/L、葡萄糖55mmol/L、HEPES 20mmol/L，pH 7.4，37℃)，并給予大黃素干預(yù)，放入50mL/L CO2孵箱中37℃培養(yǎng)6h。

1.3 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、細(xì)胞凋亡水平及上清液乳酸脫氫酶的檢測(cè)

Fluo��3/AM鈣離子熒光探針負(fù)載細(xì)胞懸液，終濃度10μmol/L，37℃避光孵育30min，PBS洗滌兩遍重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，平均熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。Annexin V�睵I雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(apoptosis rate)及正常細(xì)胞比例(normal cell rate)。AO/EB染色法熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，綠色熒光代表正常細(xì)胞，橘紅色熒光代表凋亡細(xì)胞。上清液乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)含量的檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用±s表示。統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，多重比較用LSD�瞭檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冷缺血再灌注后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、細(xì)胞凋亡水平及上清液LDH的含量

流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果中平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity, MFI)代表細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，模擬冷缺血再灌注后，各濃度大黃素處理組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。并且隨大黃素濃度增加，鈣離子濃度有降低趨勢(shì)，各濃度大黃素處理組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各濃度大黃素處理組細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組，正常細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);低濃度組與中濃度組之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但高濃度組與中、低濃度組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中、高濃度大黃素處理組培養(yǎng)上清液中LDH水平顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1、圖1)。表1 冷缺血再灌注后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、細(xì)胞凋亡水平及上清液中LDH含量的測(cè)定(略)

2.2 AO/EB染色在熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果

AO/EB染色熒光顯微鏡下觀察，高濃度大黃素處理組凋亡細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少(圖2)醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站m.f1411.cn。

3 討 論

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