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第4次課 授課時(shí)間：2006年 月 日
課程名稱 | 年級(jí) | 05級(jí) | 專業(yè)、層次 | 臨床醫(yī)學(xué)等各專業(yè)本科 | ||||
授課教師 | 鄔于川 | 職稱 | 副教授 | 課型（大、小) | 小 | 學(xué)時(shí) | 3 | |
授課題目 | 對流免疫電泳、動(dòng)物過敏實(shí)驗(yàn) | |||||||
基本教材及主要參考書 | 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 鄔于川主編 瀘州醫(yī)學(xué)院印刷廠2002 P18~19,P50 現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 沈關(guān)心、周汝麟主編 湖北科學(xué)技術(shù)出版社 1998 | |||||||
目的與要求： 掌握對流免疫電泳實(shí)驗(yàn)的原理、方法及結(jié)果分析； 掌握動(dòng)物過敏實(shí)驗(yàn)的原理及結(jié)果分析； 熟悉試管凝集試驗(yàn)的結(jié)果判定方法及意義。 實(shí)施可溶性抗原的檢測 | ||||||||
教學(xué)內(nèi)容與時(shí)間安排： 觀察上次試管凝集試驗(yàn)結(jié)果---10min 自作對流免疫電泳實(shí)驗(yàn)- --50min 動(dòng)物過敏實(shí)驗(yàn)示教--- 20min 實(shí)施可溶性抗原檢測 40min 教學(xué)方法：講授、板書、示教 | ||||||||
教學(xué)重點(diǎn)及如何突出重點(diǎn)、難點(diǎn)及如何突破難點(diǎn)： 教學(xué)重點(diǎn) 對流免疫電泳實(shí)驗(yàn)原理及結(jié)果分析 動(dòng)物過敏實(shí)驗(yàn)的原理及結(jié)果分m.f1411.cn/job/析 教學(xué)難點(diǎn) 對流免疫電泳實(shí)驗(yàn)原理及結(jié)果分析 提示：將原理與實(shí)驗(yàn)中的具體結(jié)果結(jié)合起來分析。 | ||||||||
教研室審閱意見： 教研室主任簽名： 年 月 日 | ||||||||
基本內(nèi)容 | 教學(xué)手段 | 課堂設(shè)計(jì)和時(shí)間安排 |
教學(xué)進(jìn)程 一 觀察上次試管凝集試驗(yàn)結(jié)果 【結(jié)果】 ⒈ 凝集強(qiáng)弱，以下列記號(hào)表示： ＋＋＋＋：管內(nèi)液體澄清，細(xì)菌全部凝集于管底，輕搖有大片凝集塊。 ＋＋＋：管內(nèi)液體輕度混濁，細(xì)菌大部分凝集于管底，凝集塊較小。 ＋＋：管內(nèi)液體中度混濁，細(xì)菌部分凝集于管底，凝集塊更細(xì)小。 ＋：管內(nèi)液體中度混濁，僅少量細(xì)菌凝集。 －：液體混濁，無凝集。若放置較長時(shí)間觀察結(jié)果，未凝集的，細(xì)菌亦可沉積于管底。與凝集塊沉淀物不同：前者是個(gè)小圓點(diǎn)，邊緣光滑整齊，而后者似傘狀，鋪開沉淀于管底，邊緣不整齊。 ⒉ 首先觀察第8管（對照管)。正確結(jié)果應(yīng)是管底沉淀物為圓形，邊緣整齊，輕輕振搖，細(xì)菌分散呈均勻混濁。若出現(xiàn)了非特異的凝集，則本試驗(yàn)無效。 ⒊ 試驗(yàn)管應(yīng)由第1管看起。H菌液凝集物呈疏松棉絮狀，沉于管底，輕搖時(shí)易離散和升起。 ⒋ 凝集效價(jià)的判定：與相應(yīng)菌液發(fā)生中等程度（＋＋)凝集的血清最高稀釋度為該被檢血清的凝集效價(jià)，用稀釋倍數(shù)表示之。如第1管仍無凝集現(xiàn)象，應(yīng)報(bào)“＜1∶40”，如第7管仍是“＋＋”或更強(qiáng)凝集，應(yīng)報(bào)“＞1∶2560”。 【注意事項(xiàng)】 ⒈ 抗原、抗體在比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)。如果抗體的濃度過高，則無凝集物形成，此為前帶現(xiàn)象，需要在測定結(jié)果時(shí)加以鑒別。 ⒉ 判定醫(yī).學(xué)全在線m.f1411.cn結(jié)果時(shí)，應(yīng)在暗背景下通過強(qiáng)光檢查。 ⒊ 注意溫度、PH、電解質(zhì)、振搖對本試驗(yàn)的影響。 ⒋ 觀察結(jié)果時(shí)，最好不要振搖試管，以免將凝集物搖散而影響他人觀察。 二 對流免疫電泳試驗(yàn) 【原理】 對流免疫電泳是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。將瓊脂板置于電場中，在pH8.6的緩沖液中，大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原帶負(fù)電荷向正極移動(dòng)，而抗體為球蛋白，由于暴露的極性基團(tuán)少，所帶負(fù)電荷低，且分子量較大，移動(dòng)緩慢，同時(shí)受電滲作用的影響向負(fù)極移動(dòng)（電滲是指在電場中液體對于一個(gè)固定固體的相對移動(dòng)。瓊脂是一種酸性物質(zhì)，在堿性溶液中帶負(fù)電荷，而與它接觸的液體帶正電荷，因此液體向負(fù)極移動(dòng)，產(chǎn)生電滲)。這樣抗原抗體相向運(yùn)動(dòng)，在比例適當(dāng)處形成乳白色沉淀線。由于電場的作用，限制了抗原、抗體的自由擴(kuò)散，而使其定向移動(dòng)，因而增加了試驗(yàn)的靈敏度，并縮短了反應(yīng)時(shí)間。此試驗(yàn)常用于檢測甲胎蛋白（AFP)、乙肝病毒表面抗原（HBSAg)。 【材料】 1．HBSAg陽性血清、待檢血清、抗HBSAg血清。 2．用打孔器按模型打成雙排孔，孔徑3mm，孔間距4mm，行間距4mm。 3．加樣：用毛細(xì)吸管在雙排孔的一側(cè)加入抗HBSAg血清，另一側(cè)分別加入HBSAg陽性血清和待檢血清，注意抗原抗體的位置要一致。加樣時(shí)以加滿小孔為度，注意不能讓液體溢出。 － ＋ Ag Ab Ag Ab 4、電泳：將加好樣的瓊脂板放置電泳槽上，抗原孔置負(fù)極端，抗體孔置正極端。瓊脂板兩端分別用雙層濾紙片與電泳槽中的pH8.6的巴比妥鈉緩沖液相連，接通電源，調(diào)節(jié)電流為2—4mA/cm板寬或電壓為4—6V/cm板長，電泳45—60分鐘。 5、電泳畢，關(guān)掉電源，取出瓊脂板，觀察在相應(yīng)抗原抗體孔間有無白色沉淀線出現(xiàn)。 【結(jié)果】 陽性對照孔與抗血清孔間出現(xiàn)清晰白色沉淀線。若待檢血清與抗血清孔間出現(xiàn)沉淀線為陽性，反之無沉淀線為陰性。若沉淀線不夠清晰，可在37℃下放置數(shù)小時(shí)，以增強(qiáng)沉淀線清晰度。 【注意事項(xiàng)】 1． 對流免疫電泳試驗(yàn)的靈敏度較雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)高，但由于電泳時(shí)緩沖液的離子強(qiáng)度、pH值、端電壓和電泳時(shí)間等因素的影響，有時(shí)可能出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。 2． 抗原與抗體量應(yīng)相接近，如抗原量過多，可造成假陰性結(jié)果，須通過稀釋抗原加以解決。 三 動(dòng)物（豚鼠)過敏試驗(yàn)
【原理】 豚鼠過敏試驗(yàn)屬Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，與人類的青霉素和異種血清蛋白引起的過敏性休克相似，通過了解動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性過敏性休克的方法及結(jié)果觀察，有助于加深和理解Ⅰ型超敏反應(yīng)的主要特點(diǎn)，發(fā)病機(jī)制及臨床表現(xiàn)。其基本原理是先給豚鼠注射異種蛋白，經(jīng)過一段時(shí)間，動(dòng)物產(chǎn)生IgE等親細(xì)胞型抗體，吸附于體內(nèi)組織中的肥大細(xì)胞及血液中的嗜鹼性粒細(xì)胞，使機(jī)體對該變應(yīng)原（異種蛋白)處于致敏狀態(tài)。當(dāng)?shù)诙谓o處于致敏狀態(tài)的動(dòng)物注射相同變應(yīng)原時(shí)，變應(yīng)原與肥大細(xì)胞和嗜鹼性粒細(xì)胞表面的IgE結(jié)合，引起肥大細(xì)胞和嗜鹼性粒細(xì)胞膜構(gòu)型改變，細(xì)胞脫顆粒，釋放多種活性介質(zhì)，作用于相應(yīng)效應(yīng)器官，引起各種過敏癥及過敏性休克 【材料】 1．動(dòng)物：體重150克左右的幼小豚鼠2只。 2．變應(yīng)原：雞蛋白。 3．注射器、針頭、酒精棉球 【方法】 1． 致敏注射：取健康豚鼠2只，分別編為1號(hào)、2號(hào)。 ①于1號(hào)豚鼠腹腔注射1:10卵白蛋白1ml ②2號(hào)豚鼠不注射 2．發(fā)敏注射：經(jīng)14~21天致敏后，2只豚鼠分別同時(shí)心內(nèi)注射1:10稀釋卵白蛋白1-2ml，觀察各豚鼠行為表現(xiàn)有何差異。 【結(jié)果】 1、1號(hào)豚鼠很快出現(xiàn)煩燥不安，聳毛、抓鼻、打噴嚏、痙攣性跳躍、大小便失禁等癥狀，重者數(shù)分鐘內(nèi)由于呼吸肌痙攣窒息而死亡。 2、2號(hào)豚鼠無任何癥狀發(fā)生。 檢測可溶性抗原 做清潔 | 講授、示教 ―――― 講授 板書 示教 講授 板書 示教 ――――― 講授 板書 示教 | 約10min ―――― 約70min 約30min 約5min ―――――― 約35min ― 40min 約5min |
小 結(jié) | 1、對流免疫電泳的原理 2、對流免疫電泳的方法 3、對流免疫電泳的應(yīng)用 4、動(dòng)物過敏試驗(yàn)的原理 |
復(fù) 習(xí) 思 考 題 、 作 業(yè) 題 | 思考題 1 對流免疫電泳的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)？ 2 Ⅰ型超敏反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制及相關(guān)臨床表現(xiàn)？ |
下 次 課 預(yù) 習(xí) 要 點(diǎn) | 教學(xué)錄像內(nèi)容： 一．免疫應(yīng)答 二．淋巴細(xì)胞分離技術(shù) 三．艾滋病防治常識(shí) |
實(shí) 施 情 況 及 分 析 |
