醫(yī)學(xué)蜱螨學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)
實(shí)驗(yàn)一 蜱標(biāo)本的采集、制作與保存
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/b>
掌握蜱標(biāo)本的采集、制作與保存基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
【實(shí)驗(yàn)原理】
將蜱從其宿主體表或其洞（巢)穴和宿主自然孳生地捕捉獲得后，對(duì)所采集標(biāo)本進(jìn)行收集，用生理鹽水或人氏液清洗，用物理或化學(xué)方法固定，用脫水劑將標(biāo)本脫水，以利于透明組織和保存玻片標(biāo)本，最后進(jìn)行標(biāo)本封固以保存，使標(biāo)本留存下來易于觀察。
【實(shí)驗(yàn)材料】
1. 標(biāo)本采集所需實(shí)驗(yàn)材料：采集旗、采集瓶、標(biāo)簽
2．標(biāo)本制作所需實(shí)驗(yàn)材料：解剖鏡、微型剪刀、平皿、5％KOH、系列酒精、冬青油、中性樹膠、生理鹽水
3．標(biāo)本保存所需實(shí)驗(yàn)材料：65%～75%乙醇、磨砂瓶、標(biāo)簽
【實(shí)驗(yàn)方法】
1．采集
（1)拖旗法采蜱
用白色結(jié)實(shí)棉布或法蘭絨，做成90cm×60cm旗子，一邊固定在100cm～120cm竹竿上，竹竿兩端栓上尼龍繩。拖旗法適用于林中或山間平坦處、河邊漫灘、低矮或不長荊棘的草地。采集時(shí)將旗子平鋪地面，拖拉繩子前進(jìn)，每步行10～20步即可停下檢查有無蜱類。
（2)搖旗法采蜱
搖旗法適用于密林地區(qū)，植被高度過膝，樹木交錯(cuò)，枝杈橫生，難能拖旗，可改為揮動(dòng)旗幟的方法采集蜱類。
當(dāng)發(fā)現(xiàn)有蜱，立即放入內(nèi)，加塞，貼標(biāo)簽，供鑒定、飼養(yǎng)、檢出、統(tǒng)計(jì)。如需調(diào)查密度，則在樣地均勻地拖旗或揮旗，以每人每小時(shí)或每人每100m所捕獲的蜱數(shù)統(tǒng)計(jì)，通常每一樣地不少于30min或500m。
（3)從宿主采蜱
1)家畜：如牛、羊、狗、馬、驢、駱駝、雞等。
2)野生動(dòng)物：如鼠類、鳥類、野兔、野雞等。
3)人體：多侵襲頭發(fā)、頸項(xiàng)、耳朵、腋下、多毛、易汗?jié)�、多皺褶部位�?/p>
（4)動(dòng)物棲息地采蜱
畜舍、圈欄、狗房、雞窩、鳥巢、洞穴等。
（5)誘捕法采蜱
必要時(shí)，特意放出偵察犬或其它訓(xùn)養(yǎng)動(dòng)物也可誘捕蜱類。
2．標(biāo)本制作
（1)大體標(biāo)本制作：成蟲經(jīng)過5％KOH浸泡。一般活蜱可直接浸入上液中，其體內(nèi)的血液沒有多大關(guān)系。但已固定的蜱，以體內(nèi)沒有血者為佳�？捎眉�(xì)針在蜱體兩側(cè)無關(guān)緊要處扎數(shù)小孔，再用小平鏟輕壓蜱體，使被融解的內(nèi)臟組織排出體外。用蒸餾水洗數(shù)次，每次半個(gè)小時(shí)左右。經(jīng)酒精系列脫水，每液2h左右，冬青油透明，當(dāng)見到冬青油中蟲體透明即可用中性膠封片，以防時(shí)間過久蜱變脆易折斷。
對(duì)于硬蜱，整體玻片標(biāo)本適合教學(xué)用，不宜為分類鑒定之用。因?yàn)轵珞w一經(jīng)透明就失去鑒別的特征。而軟蜱在分類鑒定時(shí)，可制成局部標(biāo)本，即將蟲體局部的背腹側(cè)剪成三角形，或?qū)⒈掣姑娣珠_，直接用膠封片。
（2) 內(nèi)部構(gòu)造標(biāo)本制片 當(dāng)活成蟲體內(nèi)血液消化時(shí)，用微型剪刀將蜱身體周緣剪開，再放入盛有生理鹽水的小玻皿中，置于解剖鏡下解剖。小心的將外皮去掉，留其內(nèi)臟組織，如消化、生殖系統(tǒng)，按照昆蟲的軟組織制片法，進(jìn)行固定、染色、脫水和封片。
3．蜱標(biāo)本保存
（1)死蜱標(biāo)本的保存技術(shù)
常用的方法是浸泡法，如酒精浸泡等。將捕獲的蜱類用70~80℃的熱水殺死，取出后稍干泡在65~75%酒精中長期保存或送交專門部門。酒精容量要比標(biāo)本多4~5倍，使蜱類標(biāo)本能固定在展肢狀態(tài)。注意要標(biāo)明標(biāo)本來源、生境、宿主、時(shí)間和采集者等信息。有時(shí)為了進(jìn)行DNA或RNA檢測(cè)分析技術(shù)，這就需要采用DNAlater或RNAlater等溶液作專門處理。
（2)活蜱標(biāo)本的保存技術(shù)
常采用的蜱盒和試管保存方法，可將洗凈消毒容器，放入消毒處理的細(xì)沙上面覆蓋棉花，再覆蓋濾紙片。然后放入反復(fù)摺皺的濾紙條（事先蘸有防霉劑如新霉素、氯霉素等)，接入活蜱可使蜱上下活動(dòng)。容器口用棉塞或絹紗封閉。注意保持容器內(nèi)的濕度，可每隔3~5天向沙子滴加無菌水，保持濕度在85%~95%、溫度在15~22℃之間為宜。
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
采集到蜱標(biāo)本，成功進(jìn)行標(biāo)本制作與保存。
【注意事項(xiàng)】
1. 蟲體在固定之前應(yīng)清洗時(shí)應(yīng)避免對(duì)蟲體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)造成損傷。
2. 標(biāo)本脫水時(shí)，應(yīng)用系列酒精使標(biāo)本從低濃度到高濃度逐步脫水。
3. 為防止脫水劑揮發(fā)或吸水等外界影響，脫水必須在有蓋的玻璃器皿中進(jìn)行。
4. 脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象，必要時(shí)候可重復(fù)脫水。
5. 固定劑新鮮配制使用為宜，如需保存應(yīng)避光、陰涼保存。
6. 封固時(shí)蓋玻片的大小以其周圍留有約為2 mm左右距離為宜。若太靠近在載片邊緣，則易使染色標(biāo)本受空氣中酸的作用而褪色。
7. 封固劑的用量應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的大小和蓋玻片的大小決定。若封固液不足應(yīng)從蓋玻片邊緣補(bǔ)足；若滴加過多時(shí)，待封片干后，將外溢的封固液去除。
實(shí)驗(yàn)二 蜱的解剖與細(xì)胞培養(yǎng)
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/b>
掌握蜱的解剖基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，熟悉蜱的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。
【實(shí)驗(yàn)原理】
對(duì)蜱進(jìn)行解剖以掌握蜱的內(nèi)部系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。通過體外給予蜱特定的理化條件和必需的基本營養(yǎng)成分進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以滿足多方面研究和防治工作的實(shí)際需要。
【實(shí)驗(yàn)材料】
1. 蜱解剖所需實(shí)驗(yàn)材料：解剖鏡、解剖針、解剖刀、玻片、平皿、生理鹽水或磷酸緩沖液、眼科鑷子、吸管、燒杯、石蠟、松香、酒精燈、小試管、試管架、胚胎皿、小燒杯等。
2. 蜱細(xì)胞培養(yǎng)所需實(shí)驗(yàn)材料：絹紗袋、注射器芯、平皿、RPMI1640培養(yǎng)基、0.5%新潔爾滅、75%酒精、胰酶、EDTA溶液、無Ca2+、 Mg2+ 的Hanks液
【實(shí)驗(yàn)方法】
1．解剖
首先是軀體固定，取一滴加熱融化的速干膠滴在潔凈的玻片上。將蜱背面向上，頭向前，用眼科鑷子將其平放在膠滴中間，1min左右即粘固在玻片上。然后是切除背板、背板的切除，從肩突開始，沿體側(cè)溝用手術(shù)刀做一個(gè)切環(huán)，直至對(duì)側(cè)肩突，再在假頭和背板上緣做一橫切。接下來是摘除背板，用眼科鑷子左手夾注已切開的背板左上側(cè)，右手用解剖針小心地由上往下緊帖背板，剝離粘在其上的支氣管束和結(jié)締組織，這時(shí)應(yīng)將玻片放在盛有生理鹽水的平皿內(nèi)。右手邊剝離左手邊向下拉，直到取盡為止。最后是取出消化器官等。以消化器官為例，用鑷子夾住中腸前部，用解剖針在食管部位將腸管切斷，再慢慢由上向下將剝離的消化器官取出，包括馬氏管、直腸囊、唾液腺、卵巢、睪丸等一起取下，分別放于胚胎皿中，依工作需要進(jìn)行固定、組織切片或細(xì)胞培養(yǎng)。
2．細(xì)胞培養(yǎng)
以蜱卵為例，可先將蜱卵放于絹紗袋中，用蒸餾水漂洗2~3次，然后用0.5%新潔爾滅消毒10min，再用蒸餾水漂洗2~3次，放入75%酒精中消毒10min，再用蒸餾水漂洗2~3次，在用1640液漂洗1洗后于小平皿內(nèi)用注射器芯擠壓破碎，去出卵殼后，接入培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)。如需增加原代細(xì)胞的貼壁能力，可先在培養(yǎng)瓶中放入胎牛血清使瓶壁薄薄覆蓋，以增加原代細(xì)胞的貼壁能力。待細(xì)胞不斷生成，貼壁成單層后，可用胰酶消化分散細(xì)胞，可進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)時(shí)，首先要分散細(xì)胞，可采用胰酶溶液或EDTA溶液進(jìn)行分散。分散時(shí)可先將原培養(yǎng)液棄去，用無Ca2+、 Mg2+ 的Hanks溶液洗2次，再加入胰酶消化液28℃消化2~5min，當(dāng)細(xì)胞間隙松動(dòng)，肉眼可見單層細(xì)胞呈“發(fā)毛”現(xiàn)象時(shí)，小心棄去消化液，反復(fù)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，見細(xì)胞脫落時(shí)，將瓶用手掌輕輕一拍，使大片細(xì)胞脫落，然后用培養(yǎng)液將細(xì)胞從瓶壁吹下，分散成單個(gè)細(xì)胞，再依據(jù)細(xì)胞量進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。蜱細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇，依照緩凍速復(fù)的原則進(jìn)行。
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
1. 成功解剖蜱，見其內(nèi)部系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，如下圖肩板硬蜱：
圖2-1 肩板硬蜱I. scapularis內(nèi)部系統(tǒng)解剖圖
2. 對(duì)蜱卵成功培養(yǎng)。
【注意事項(xiàng)】
1. 速干膠不宜太熱將標(biāo)本燙壞，也不宜太涼粘不住，用玻璃棒蘸起成滴狀即可。
2. 進(jìn)行標(biāo)本解剖時(shí)應(yīng)將玻片放在盛有生理鹽水的平皿內(nèi)，以覆蓋住蜱標(biāo)本的水量即可，可避免內(nèi)臟因干枯而破裂。
3. 原代培養(yǎng)時(shí)因組織和細(xì)胞剛剛離開機(jī)體，在人工環(huán)境中需要培養(yǎng)液更接近它原來的體液才有利于其生存和培養(yǎng)，應(yīng)適當(dāng)加大小牛血清或胎牛血清的含量（15%~30%)，必要時(shí)可加入蜱組織研磨液，以提供生長激素等彌補(bǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)差異。
4. 胰酶溶液要用無Ca2+、 Mg2+ 的Hanks液配制。
實(shí)驗(yàn)三 革螨的標(biāo)本及染色體標(biāo)本的制備
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/b>
（一) 掌握革螨成蟲的形態(tài)特征。
（二) 掌握革螨成蟲標(biāo)本的采集、固定、制作、染色和保藏。
（三) 掌握同工酶技術(shù)在革螨中的應(yīng)用，熟悉了解其他新技術(shù)、新方法在革螨診斷中的應(yīng)用。
一、內(nèi)容：
（一) 示教與觀察：
1． 革螨成蟲
2． 革螨蟲卵
（二) 技術(shù)操作：
1． 革螨的采集
動(dòng)物巢穴和外界環(huán)境：動(dòng)物巢穴中的革螨，無論種類、數(shù)量、蟲期、生態(tài)均較宿主體上的多而復(fù)雜。采集標(biāo)本時(shí)，將巢穴內(nèi)容物（窩草、糞土、雜物等)都收集到白布袋中，扎緊袋口并標(biāo)簽。自由生活型革螨常棲息于枯枝爛葉下、稻草堆、住屋塵土、倉貯下層、糞堆等，按不同采集地點(diǎn)，分別存放于白布袋里，附上標(biāo)簽及編號(hào)。
2． 革螨的收集
收集革螨最好用電熱集螨器方法，原理是利用熱、干燥和光驅(qū)使革螨爬到集螨器下端的收集管里。如無集螨器或少量標(biāo)本，則可放于搪瓷盤內(nèi)用長鑷子或解剖針逐一撥動(dòng)被檢物，同上法取螨，同樣也要檢查布袋中的螨。
采到的革螨一般可直接放入70%酒精中保存，若用加熱約70℃的70%~80%酒精固定活螨或先用熱水約70℃燙一下再放酒精中固定，則可使螨體附肢伸直，制成的標(biāo)本美觀且有利于鑒定。如需活螨則可直接挑入大型、中型或小型飼養(yǎng)器中飼養(yǎng)或觀察。
3． 革螨染色體標(biāo)本的制備
玻璃紙壓片法
（1)取早期胚組織革螨卵，置于潔凈的載玻片或蓋玻片上。
（2)覆蓋1cm2左右玻璃紙，玻璃紙預(yù)先浸于45%冰醋酸水溶液中數(shù)分鐘。
（3)擊破卵殼，使胚細(xì)胞鋪展，靜置2~3min。
（4)壓片：在玻璃紙上再覆蓋一片吸水濾紙，用拇指均勻用力壓片。
（5)固定：滴加甲醇—冰醋酸（3:1)或96%酒精，反復(fù)固定3~5 min。
（6)染色：翻轉(zhuǎn)玻璃紙，用pH7.0的0.01mol/L磷酸緩沖液稀釋的5%Giemsa液染色30 min。
（7)水淋洗，待干、鏡檢、攝影。
（8)如螨卵較多，采用氣干法制片，效果更佳。
C分帶——BSG法
（1)取新鮮制備尚未染色的染色體標(biāo)本，置于0.2N HCl中室溫下處理5 min。
（2)將標(biāo)本浸入預(yù)熱至50~60℃的5%Ba(OH)2水溶液中10 min，取出用熱蒸餾水洗3次。
（3)于60℃的2×SSC（氯化鈉17.54g，枸緣酸鈉8.82g，蒸餾水加至1000ml)溶液中處理1h，水洗。
（4)用5%Giemsa液（同前)染色30~60 min。水洗、待干、鏡檢。著絲粒區(qū)呈深紫紅色，染色體其他部位呈淺紅色。
實(shí)驗(yàn)四 恙螨標(biāo)本恙蟲病東方體DNA的提取
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/b> 掌握恙螨標(biāo)本恙蟲病東方體DNA的提取
【實(shí)驗(yàn)原理】 在EDTA（鰲合二價(jià)陽離子以抑制DNase)存在的情況下。用蛋白酶K消化真核細(xì)胞或組織，用去垢劑如SDS溶解細(xì)胞膜并使蛋白質(zhì)變性。蛋白酶的作用是消化蛋白質(zhì)，膜蛋白的消化對(duì)破壞膜結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞裂解有巨大的促進(jìn)作用；巨大的基因組 DNA 都是纏繞在大分子的蛋白（核小體)上的，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被蛋白酶消化變小后，基因組 DNA就被釋放出來，這樣一方面有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，一方面釋放出更多的基因組 DNA 提高核酸的產(chǎn)量。
【實(shí)驗(yàn)材料】
1. 恙螨標(biāo)本：恙螨蒸餾水浸泡2h，中間換水1次，洗凈的恙螨置于研磨器，加適量的TE液研磨成懸液備用。
2．設(shè)備 移液管、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋。
3．試劑
1)分離緩沖液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4，10mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA。
2)10% SDS，蛋白酶 K（20mg/ml或粉劑)
3)乙醚，酚:氯仿:異戊醇（25:24:1)
4)其它試劑：無水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
【實(shí)驗(yàn)方法】
1. 將恙螨TE研磨液(或其他標(biāo)本的樣品)吸取100μl于Eppendorf管中，加1/10體積的10%十二烷基硫酸鈉（SDS)，混勻，置4℃冰箱過夜；
2. 加10 mg/ml 溶菌酶至終濃度為2mg/ml，冰浴30min，加10mg/ml蛋白酶K至終濃度為2mg/ml，55℃水浴1~2h。
3. 加入等體積的酚，混勻10min，離心5 000rpm 5min，吸出水相，用酚重新抽提一次；用氯仿-異戊醇重復(fù)抽提2次；
4. 加入1/20體積5M氯化鈉，2倍體積的無水乙醇，-20℃冰箱過夜，離心去上清，加入70%乙醇振蕩洗滌，去上清晾干，取20μl TE溶解沉淀，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
1. DNA溶液稀釋20-30倍后，測(cè)定OD260 /OD280比值， 明確DNA含量和質(zhì)量。
2. 取2-5μl 在0.7% agarose膠上電泳， 檢測(cè)DNA的分子大小。
【注意事項(xiàng)】
1. 選擇的實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，處理時(shí)間不易過長。
2. 在加入細(xì)胞裂解緩沖液前，細(xì)胞必須均勻分散，以減少DNA團(tuán)塊形成。
3. 抽提每一步用力要柔和，防止機(jī)械剪切力對(duì)DNA的損傷。
4. 取上層清液時(shí)，注意不要吸起中間的蛋白質(zhì)層。
5. 乙醇漂洗去乙醇時(shí)，不要蕩起DNA。小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。
6. 離心后，不要晃動(dòng)離心管，拿管要穩(wěn)，斜面朝外。
實(shí)驗(yàn)五 粉螨的采集、分離和保存
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/b>
學(xué)會(huì)粉螨的采集、分離和保存方法
【實(shí)驗(yàn)原理】
了解了粉螨的孳生環(huán)境采集粉螨，粉螨有避光爬附性，粉螨足跗節(jié)端部多具爪墊，在爬行時(shí)能附著在物體表面上。
【實(shí)驗(yàn)材料】
密封塑料袋5個(gè)、零號(hào)毛筆5支、平底搪瓷盤10個(gè)、黑紙板10個(gè)、凡士林、廣口瓶（及軟木塞)一個(gè)、指形管5個(gè)、脫脂棉、標(biāo)簽紙、炭素筆
【實(shí)驗(yàn)方法】
1. 采集：面粉廠的地腳粉，米廠的地腳米及其細(xì)糠，中藥廠剁藥車間的灰塵及碎藥材渣、沫，中藥材柜灰塵等；
2. 分離：選平底搪瓷盤蓋和黑紙板（遮光黑紙板或三合板上貼黑紙)，或在平皿內(nèi)墊一黑紙（小樣本收集多采用平皿)，劃定面積作為爬附區(qū)；將樣本平展其上，置于光照之下，每隔15~20min把樣本輕輕拍轉(zhuǎn)到下一爬附區(qū)。若不計(jì)數(shù)每次爬附所獲得螨數(shù)，只是為了收獲粉螨，則可放置數(shù)小時(shí)（一般4~6h)，任其爬附。為了防止粉螨逃脫，在爬附區(qū)周圍可涂一圈粘性物質(zhì)。最后用毛筆收集螨。
3. 保存：將采集到的粉螨直接制成玻片標(biāo)本，或放在保存液中留待以后制作。常用的兩種保存液為：① 70％~80％乙醇；② 奧氏保存液（Oudemans fluid)。奧氏保存液的配方為：70％乙醇87份，冰醋酸8份，甘油5份。配制方法：將純酒精用蒸餾水稀釋到濃度70％后，加入冰醋酸和甘油，搖勻備用。
保存前，用零號(hào)毛筆（較小的粉螨可應(yīng)用毛發(fā)針，毛發(fā)針即是在解剖針的針尖上粘l~2根毛發(fā)而成)“挑取”粉螨，放人濃度為50％~70％的熱酒精（70~80℃)中固定，使其肢體伸展，姿勢(shì)正常；再放入盛有奧氏保存液的指形管中，用脫脂棉塞塞口后，放人盛有同樣保存液的廣口瓶中，軟木塞塞口。對(duì)于少量粉螨標(biāo)本，可用青霉素針劑瓶盛放標(biāo)本，蓋子蓋緊后用膠布封嚴(yán)。應(yīng)用碳素墨水筆記錄采集地點(diǎn)、時(shí)間、采集人姓名、寄主等，并隨粉螨標(biāo)本一起放入盛有保存液的指形管中或小瓶中保存，此法也稱為雙重溶液浸漬法。
粉螨保存瓶
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】收集并保存一定數(shù)量的粉螨
【注意事項(xiàng)】
1.所采集到的標(biāo)本要根據(jù)時(shí)間、地點(diǎn)、材料的不同，單獨(dú)裝袋并加注標(biāo)簽。防止交叉感染。
2.注意掌握粉螨的爬附時(shí)間，時(shí)間太短還未附著好，時(shí)間太長粉螨容易粘在凡士林上。
實(shí)驗(yàn)六 粉螨標(biāo)本的制作
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/b>學(xué)會(huì)制作粉螨標(biāo)本。
【實(shí)驗(yàn)原理】粉螨可在封固劑中透明、保存，便于觀察鑒定。
【實(shí)驗(yàn)材料】粉螨、毛發(fā)針、載玻片、蓋玻片、100％乳酸20ml、蒸餾水50ml、水合氯醛醛5g、甘油20ml、阿拉伯膠結(jié)晶30g、無色指甲油、電吹風(fēng)
【實(shí)驗(yàn)方法】
1．臨時(shí)標(biāo)本
（1)臨時(shí)封固劑 ：50％～100％乳酸；將粉螨直接封入50％~100％乳酸中。
（2)將粉螨直接封入50％~100％乳酸中，放在約60℃的板上加熱，冷卻后即可。
2．永久標(biāo)本
（1)永久封固劑 ：Faure改進(jìn)的貝氏封固劑，配方為；蒸餾水50ml、水合氯醛醛5g、甘油20ml、阿拉伯膠結(jié)晶30g配制方法：按上述順序混合后用絹篩過濾，著過濾不暢，可稍微加熱后過濾。
（2) a. 直接用活螨制作標(biāo)本，也可把保存液中保存的螨類，用吸管吸出并置濾紙上吸干以后制作標(biāo)本。b. 用玻棒蘸取一些封固劑滴在載玻片中央2~3滴，將粉螨標(biāo)本2~3只或更多置于封固劑中，用毛發(fā)針攪動(dòng)，以清除粉螨軀體及足上的雜質(zhì)，或者將分離的粉螨置于盛有清水的平皿內(nèi)洗滌；c. 另取一塊滴加一滴封固劑的載玻片，將“洗浴”后的粉螨用毛發(fā)針移到封固劑中，加蓋玻片。d. 加熱：電吹風(fēng)法是利用電吹風(fēng)的熱風(fēng)加熱玻片標(biāo)本，當(dāng)封固劑出現(xiàn)氣泡或開始沸騰時(shí)，停止加熱，冷卻后即可。此法容易掌握，制成的粉螨玻片標(biāo)本透明，8足挺展。e. 玻片標(biāo)本完全干燥后，在相對(duì)濕度較大的地區(qū)，可在蓋玻片四周涂封一層元色指甲油，以防封固劑發(fā)霉和回潮。f. 在玻片標(biāo)本的右方粘貼標(biāo)簽，標(biāo)簽上寫明粉螨的學(xué)名和漢名、采集地點(diǎn)、采集時(shí)間、采集人姓名以及寄主等。
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 制作出粉螨臨時(shí)及永久標(biāo)本
【注意事項(xiàng)】 封固劑的量要適當(dāng)，以蓋玻片蓋上后正好鋪滿但不外溢為宜。對(duì)背面隆起的粉螨，可在封固劑中放人3~4塊碎蓋片后再加蓋玻片，以免標(biāo)本被壓碎或變形。
螨類玻片標(biāo)本制作程序
實(shí)驗(yàn)七 大學(xué)生蠕形螨流行病學(xué)調(diào)查
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/b>
1. 掌握蠕形螨檢查的常用方法
2. 了解本校大學(xué)生蠕形螨的感染率
【實(shí)驗(yàn)原理】
蠕形螨寄生在人體的毛囊和皮脂腺內(nèi)，利用擠壓或粘貼的物理方法，將蠕形螨檢出。
【實(shí)驗(yàn)方法】
（1)擠壓刮拭法：用皮膚刮鏟或蘸水筆尖后鈍端從受檢部位皮膚，如鼻溝、鼻尖部、頰、頦等部位直接刮取皮脂。刮拭時(shí)，用雙手拇指相距l(xiāng)cm左右先壓后擠壓刮拭部位。將刮取的皮脂置于載玻片上，滴加適量70％甘油（一般1滴即可)，與之混勻，覆以蓋片即可鏡檢；若要以皮脂定量計(jì)算感染度，可將刮取的皮脂放入特制的皮脂定量檢螨器的定量糟內(nèi)，然后取出置于載玻片上，按上述步驟涂片鏡檢，分別計(jì)數(shù)皮脂蠕形螨和毛囊蠕形螨的數(shù)量。
（2)透明膠紙法：囑被檢對(duì)象于睡眠前進(jìn)行面部清潔（洗臉)，用寬1.2cm、長5cm的透明膠帶貼于受檢部位皮膚上，次晨揭下，貼回載玻片上鏡檢，如不夠透明可于膠紙上滴加少許70％甘油。此法可以面積定量計(jì)算螨的感染度，具有定時(shí)、定點(diǎn)、定量的優(yōu)點(diǎn)。
【實(shí)驗(yàn)材料】
皮膚刮鏟、載玻片、透明膠紙、甘油等
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
【注意事項(xiàng)】
1．?dāng)D壓刮拭法操作時(shí)要注意力度，以免刮破皮膚，造成感染。
2．獲得的標(biāo)本要立刻鏡檢，以防蠕形螨蟲體裂解。
實(shí)驗(yàn)八 疥螨標(biāo)本采集與制作保存技術(shù)
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/b>
采集疥螨標(biāo)本，再制片保存，以便進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)等科研及教學(xué)方面的研究。
【實(shí)驗(yàn)原理】
將生活在“隧道”中的活疥螨采集，可用于生態(tài)學(xué)研究，或?qū)⒔牝龢?biāo)本固定后再制片保存以便進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究及教學(xué)。
【實(shí)驗(yàn)材料】蓋玻片與載玻片、6號(hào)注射針頭、消毒手術(shù)刀、雙目解剖鏡、離心機(jī)、烤箱、蒸餾水、70％酒精或2％中性戊二醛、Berlese液或Hoyer液、聚乙烯醇、10％NaOH或KOH、60％，70％，80％，85％，90％，95％及100％酒精、加拿大樹膠。
【實(shí)驗(yàn)方法】
1. 疥螨標(biāo)本的采集：
(1)針挑法：選用消毒的6號(hào)注射針頭，持針與皮膚平面呈10°～20°角，針口斜面向上，在“隧道”末端距螨點(diǎn)約1mm處垂直于“隧道”長軸進(jìn)針，直插至螨點(diǎn)底部并繞過螨體，然后放平針桿(呈5°～10°)并稍加轉(zhuǎn)動(dòng)，疥螨即落入針口孔槽內(nèi)，緩慢挑破皮膚或直接退出針頭。
(2)解剖鏡鏡檢法：讓就診者將手及掌腕部置于4×10或2.5×10的雙目解剖鏡視野下，檢查者利用45°角入射的強(qiáng)光源(100瓦普通燈泡)，在其指?jìng)?cè)及掌腕等嫩薄皮膚的皮損處觀察，可清晰的看到疥瘡患者的疥螨“隧道”及其內(nèi)的疥螨輪廓和所在部位。然后，用消毒的尖頭手術(shù)刀挑出。
采集的疥螨標(biāo)本應(yīng)先用70％酒精或2％中性戊二醛固定4～5d后再制片保存，以便進(jìn)行形態(tài)學(xué)等方面的研究。
2. 疥螨標(biāo)本的制作
(1)半永久性標(biāo)本制作法：用Berlese液或Hoyer液等水溶性封固劑制片，按封固恙螨幼蟲標(biāo)本的方法操作。但是這些封固劑中的水合氯醛和甘油都會(huì)吸收水分，易使烤干的標(biāo)本反潮、混濁。因此，必須用干漆或聚乙烯醇在蓋玻片周圍加邊，以延長保存時(shí)間，若制片標(biāo)本放置日久，標(biāo)本出現(xiàn)過透明，使疥螨結(jié)構(gòu)模糊，或蓋玻片內(nèi)產(chǎn)生氣泡和霉菌時(shí)，可將蓋玻片周圍的干漆或聚乙烯醇用小刀輕輕刮掉，然后將標(biāo)本插入載玻片缸內(nèi)，用蒸餾水浸泡2～3d，至蓋玻片與載玻片自動(dòng)分離后，取出螨體，再用上述同樣方法制片。
(2)永久性標(biāo)本封片法：將固定后的標(biāo)本，浸泡在10％NaOH或KOH水溶液中4～8h，然后水洗3次，每次10～20min，繼而經(jīng)60％，70％，80％，85％，90％，95％及100％酒精脫水，在每級(jí)酒精內(nèi)的脫水時(shí)間為10min，再經(jīng)冬青油透明后，用中性加拿大樹膠封片。為了避免疥螨標(biāo)本在操作中丟失，因此腐蝕、水洗、脫水、透明的全過程，要在離心沉淀的條件下進(jìn)行，每次離心沉淀1 500 r/min，5min。借助解剖鏡，選取完美的標(biāo)本，用加拿大樹膠封固后，平放在50～60℃的烤箱內(nèi)烤干保存。
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
采到結(jié)構(gòu)完整、活動(dòng)度好的活疥螨；制作的標(biāo)本應(yīng)觀察到結(jié)構(gòu)清晰、完整，透明度較好的疥螨。
【注意事項(xiàng)】
1. 針挑法在持針與皮膚平面呈10°～20°角，針口斜面向上，動(dòng)作輕柔，否則得到的螨體將不完整。
2. 半永久性標(biāo)本制作時(shí)必須用干漆或聚乙烯醇在蓋玻片周圍加邊，以延長保存時(shí)間。
3. 永久性標(biāo)本封片法時(shí)，為了避免疥螨標(biāo)本在操作中丟失，因此腐蝕、水洗、脫水、透明的全過程，要在離心沉淀的條件下進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)九、PCR技術(shù)在蜱螨學(xué)研究中的應(yīng)用
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/b>
１、熟悉PCR技術(shù)的原理。
２、掌握PCR技術(shù)的操作步驟。
【實(shí)驗(yàn)原理】
PCR（Polymerase ChainReaction，聚合酶www.med126.com鏈反應(yīng))是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法。它包括三個(gè)基本步驟：（1)變性（Denature)：目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈；（2)退火（Anneal)：兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度（50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對(duì)；（3)延伸（Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成。由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)25～35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106 倍。
一、 PCR反應(yīng)中的主要成份
1、引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：（1)引物長度約為16-30bp，太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高。太長則比較浪費(fèi)，且難以合成。（2)引物中G+C含量通常為40%～60%，可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度 Tm＝4（G+C)+2（A+T)。（3)四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3"端不存在連續(xù)3個(gè)G或C，因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。（4)引物3"端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng)，以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。（5)在引物內(nèi)，尤其在3"端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。（6)兩引物之間尤其在3"端不能互補(bǔ)，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 （7)引物5"端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等。 通常應(yīng)在5"端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。（8)引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響產(chǎn)量。（9)簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子，例如選用只有一種密碼子的Met，3"端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。
一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2～1.0µmol/L。引物過多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體，過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計(jì)，可精確計(jì)算引物濃度，在1cm光程比色杯中，260nm下，引物濃度可按下式計(jì)算：
X mol/L＝OD260/ A（16000)+C（70000)+G（12000)+T（9600)
X： 引物摩爾濃度，A、C、G、T：引物中4種不同堿基個(gè)數(shù)。
2、4種三磷酸脫氧核苷酸（dNTP)：dNTP應(yīng)用NaOH將pH調(diào)至7.0，并用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確濃度。dNTP原液可配成5～10mmol/L并分裝，-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20～200μmol/L。理論上4種dNTP各20μmol/L，足以在100μl反應(yīng)中合成2.6μg的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。
3、Mg2+：Mg2+濃度對(duì)Taq DNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實(shí)性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為0.5～2mmol/L。對(duì)于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1～5mmol/L的遞增濃度的Mg2+進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，選出最適的Mg2+濃度。在PCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)，例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響Mg2+離子濃度的物質(zhì)，以保證最適Mg2+濃度。
4、模板：PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子（線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好)。就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102～105個(gè)拷貝，對(duì)于單拷貝基因，這需要0.1μg的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA。擴(kuò)增多拷貝序列時(shí)，用量更少。靈敏的PCR可從一個(gè)細(xì)胞，一根頭發(fā)，一個(gè)孢子或一個(gè)精子提取的DNA中分析目的序列。模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影響PCR的效率。
5、Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130min，95℃ 40min，97℃ 5min�，F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時(shí)間。Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30min，摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率，一般PCR中出錯(cuò)率為2×10-4核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意。在100μl PCR反應(yīng)中，1.5～2單位的Taq DNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán)。所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p。酶量過多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。反應(yīng)結(jié)束后，如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，需要預(yù)先滅活Taq DNA聚合酶，滅活Taq DNA聚合酶的方法有：（1)PCR產(chǎn)物經(jīng)酚：氯仿抽提，乙醇沉淀。（2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。（3)99～100℃加熱10min。目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。
6、反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10～50mmol/L Tris·Cl（20℃下pH8.3～8.8)，50mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的Mg2+。Tris·Cl在20℃時(shí)pH為8.3～8.8，但在實(shí)際PCR反應(yīng)中，pH為6.8～7.8。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇（DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA)，它們可穩(wěn)定酶活性，另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對(duì)擴(kuò)增較長的DNA片段有利。各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。
二、PCR反應(yīng)參數(shù)
1、變性：在第一輪循環(huán)前，在94℃下變性5～10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈，然后加入Taq DNA聚合酶（hotstart)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對(duì)的引物與模板復(fù)合物所造成的錯(cuò)誤。變性不完全，往往使PCR失敗，因?yàn)槲醋冃酝耆腄NA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，減少DNA產(chǎn)量。一般變性溫度與時(shí)間為94℃ 1min。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取?duì)于富含GC的序列，可適當(dāng)提高變性溫度。但變性溫度過高或時(shí)間過長都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。
2、退火：引物退火的溫度和所需時(shí)間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對(duì)程度以及引物的濃度。實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃。一般當(dāng)引物中GC含量高，長度長并與模板完全配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并，只用兩種溫度（例如用60℃和94℃)完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，既省時(shí)間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成，反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。通常退火溫度和時(shí)間為37℃～55℃，1～2min。
3、延伸：延伸反應(yīng)通常為72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃。實(shí)際上，引物延伸在退火時(shí)即已開始，因?yàn)門aq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃～85℃。延伸反應(yīng)時(shí)間的長短取決于目的序列的長度和濃度。在一般反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。延伸時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對(duì)很低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，都需要一步較長時(shí)間（10～30min)的延伸反應(yīng)，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物，這對(duì)以后進(jìn)行克隆或測(cè)序反應(yīng)尤為重要。
4、循環(huán)次數(shù)：
當(dāng)其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25～30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會(huì)使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25～30輪循環(huán)擴(kuò)增后，反應(yīng)中Taq DNA聚合酶已經(jīng)不足，如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠醫(yī)學(xué)全.在線，需要進(jìn)一步擴(kuò)增，可將擴(kuò)增的DNA樣品稀釋103～105倍作為模板，重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增，這樣經(jīng)60輪循環(huán)后，擴(kuò)增水平可達(dá)109～1010 。
擴(kuò)增產(chǎn)物的量還與擴(kuò)增效率有關(guān)，擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用下列公式表示：C＝C0（1+P)n。其中：C為擴(kuò)增產(chǎn)物量，C0為起始DNA量，P為增效率，n為循環(huán)次數(shù)。
在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。
第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑
一、材料
不同來源的模板DNA。
二、設(shè)備
移液器及吸頭，硅烷化的PCR小管，DNA擴(kuò)增儀（PE公司)，瓊脂糖凝膠電泳所需設(shè)備（電泳槽及電泳儀)，臺(tái)式高速離心機(jī)。
三、試劑：
1. 10×PCR反應(yīng)緩沖液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0%Triton X-100。
2. MgCl2：25mmol/L。
3. 4種dNTP混合物：每種2.5mmol/L。
4. Taq DNA聚合酶5U/μl。
5. 其它試劑：1%瓊脂糖，5×TBE。
第三節(jié) 操作步驟
一、PCR反應(yīng)
1.依次混勻下列試劑
| H2O | 35μl |
| 10×PCR反應(yīng)緩沖液 | 5μl |
| 25mmol/L MgCl2 | 4μl |
| 4種dNTP | 4μl |
| 上游引物（引物1) | 0.5μl |
| 下游引物（引物2) | 0.5μl |
| 模板DNA（約1ng) | 0.5μl |
混勻后離心5秒。
2.將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，迅速離心數(shù)秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。
3.用94℃變性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)35輪，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下保溫10min，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。
二、電泳
取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長度。
【注意事項(xiàng)】
1、PCR非常靈敏，操作應(yīng)盡可能在無菌操作臺(tái)中進(jìn)行。
2、吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌，每次吸頭用畢應(yīng)更換，不要互相污染試劑。
3、加試劑前，應(yīng)短促離心10秒鐘，然后再打開管蓋，以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。
4、應(yīng)設(shè)含除模板DNA所有其它成分的負(fù)對(duì)照。
【思考題】
1、降低退火溫度對(duì)反應(yīng)有何影響？
2、延長變性時(shí)間對(duì)反應(yīng)有何影響？
3、循環(huán)次數(shù)是否越多越好？為何？
4、如果出現(xiàn)非特異性帶，可能有哪些原因？
皖南醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)碩士點(diǎn)
2006．7．3
