第十五章 臨床前藥物實(shí)驗(yàn)
第一節(jié) 藥物半數(shù)致死量(LD50)的測定
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/b>】
(1)掌握測定藥物L(fēng)D50的藥理學(xué)方法，理解藥物L(fēng)D50測定的原理及意義。
(2)熟悉尼可剎米的毒性作用。
【實(shí)驗(yàn)原理】
1.LD50的概念：引起50%的實(shí)驗(yàn)動物死亡的藥物劑量。
2.測定LD50的原理：藥物的給藥劑量與動物的死亡百分率間呈正態(tài)分布，以對數(shù)劑量為橫坐標(biāo)、死亡百分率為縱坐標(biāo)作圖，可得到一對稱S型曲線；logLD50恰在橫軸中點(diǎn)。據(jù)此，如果求出正態(tài)曲線橫軸中點(diǎn)或正S型曲線中點(diǎn)，所對應(yīng)的橫軸上的值, 即為LgLD50。所以用數(shù)學(xué)方法，計算公式為：LD50= lg–1（ΣC/Σn)，其中n為各組實(shí)驗(yàn)動物數(shù)，C為各組的對數(shù)劑量與各組實(shí)驗(yàn)動物數(shù)n的乘積。
3.測定LD50的意義：LD50值常被選作反映藥物毒性、評價藥物安全性的指標(biāo)。
4.尼可剎米產(chǎn)生毒性作用的原理：尼可剎米是一種中樞興奮藥，對呼吸中樞有直接的興奮作用，其產(chǎn)生毒性并引起死亡的原因主要為驚厥、呼吸肌強(qiáng)直性痙攣和呼吸衰竭等。
【實(shí)驗(yàn)對象】
體重相近的健康小鼠20～30只，雌雄不限。
【實(shí)驗(yàn)藥品與器材】
尼可剎米溶液、1ml注射器、針頭、鼠籠、電子天平、苦味酸。
【實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)】
實(shí)驗(yàn)動物死亡現(xiàn)象的判別和藥物用量的記錄。
【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】
1.預(yù)實(shí)驗(yàn)
① 探索劑量范圍：取小鼠12～16只，每組4只，選擇一定濃度的尼可剎米溶液腹腔注射給藥，觀察動物10分鐘內(nèi)是否死亡，找出引起100%及0%死亡率所需藥物的劑量范圍Dm及Dn——如4只小鼠全部死亡則降低一半劑量，如4只小鼠全不死則增加一倍劑量,確定Dm值后按組間比1：2逐步降低劑量，直至確定出Dn。（此步驟在開課前由帶教老師完成，參考值：Dm約為1750mg/kg，Dn約為600mg/kg)。
② 確定劑量組數(shù)，計算各組劑量并配制相應(yīng)不同濃度的藥液：實(shí)驗(yàn)動物以4～9個劑量組為宜，各組劑量按等比數(shù)列排列，組間的比值以0.70～0.85為宜，以Dm劑量配制最高濃度組藥液，而以Dn劑量配制最低濃度組藥液。注意：小鼠腹腔注射給藥容量一般采用0.2ml/10g，應(yīng)保證每劑量組每10g體重小鼠的用藥容量相等。
2.正式實(shí)驗(yàn)
各組取體重相近的健康小鼠10只，稱體重后分別作標(biāo)記，將實(shí)驗(yàn)用不同濃度的尼可剎米系列藥液觀察實(shí)驗(yàn)動物按從高到低的順序逐一用藥；第一只動物用藥后如死亡，下一只動物就降低一級劑量給藥；相反，如果存活，下一只動物就提高一級劑量給藥，依此類推，直至10只動物都做完為止。在表中記錄時，動物死亡用“＋”表示，未死亡用“－”表示。若在同一劑量中連續(xù)出現(xiàn)“－”兩次，則下一次實(shí)驗(yàn)結(jié)束，最后一只動物不做實(shí)驗(yàn)（根據(jù)上一個小鼠結(jié)果即可確定其所在的劑量組位置)，但在表格中占一個，用E表示。
表15-1尼可剎米半數(shù)致死量的測定結(jié)果
| 劑量 (D，mg/kg) | 劑量對數(shù) （lgX) | 實(shí)驗(yàn)結(jié)果紀(jì)錄 | 死亡數(shù) (n1) | 存活數(shù) (n2) | n (n1+n2) | C (n×lgX) |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 | ||||||
| Σn= | ΣC= |
統(tǒng)計上表中的結(jié)果，帶入下面公式中計算：LD50 = lg–1（ΣC/Σn)
【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】
1.動物分組的隨機(jī)性：各組動物在性別、體重等要保證均勻一致性；
2.腹腔注射的正確操作；
3.組間劑量等比設(shè)置。
4.尼克剎米溶液最好試驗(yàn)前新鮮配制
【思考題】
1. 用LD50評價藥物的醫(yī)學(xué)全.在線安全性有何缺點(diǎn)？
2. 評價藥物的安全性的指標(biāo)還有哪些
涂劍 謝志忠
第二節(jié) 不同給藥途徑對藥物效應(yīng)的影響
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/b>】
（1)觀察不同給藥途徑給予相同劑量的尼可剎米時，所引起藥理作用量的差異。
（2)觀察不同給藥途徑給予相同劑量的硫酸鎂時，所引起藥理作用質(zhì)的差異。
【實(shí)驗(yàn)原理】
藥物在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的藥理作用和效應(yīng)受藥物和機(jī)體的多種因素影響，主要因素有藥物方面、給藥方法和機(jī)體這三大方面。凡能影響上述因素，都可影響藥物作用。影響的結(jié)果表現(xiàn)為藥動學(xué)差異和藥效學(xué)差異，這兩方面的差異均能導(dǎo)致藥物反應(yīng)的個體差異。個體差異在絕大多數(shù)情況下只是“量”的不同，即藥物產(chǎn)生的作用大小或是作用時間長短不同；但有時藥物作用出現(xiàn)“質(zhì)”的差異，產(chǎn)生了不同性質(zhì)的反應(yīng)。
尼可剎米主要是直接興奮延腦呼吸中樞，也可刺激頸動脈體和主動脈體化學(xué)感受器，反射性興奮呼吸中樞，并能提高呼吸中樞對CO2的敏感性，使呼吸頻率加快，呼吸深度加深，通氣量增加，呼吸功能改善。但劑量過大亦可致血壓升高、心動過速、肌震顫及僵直等，中毒時可出現(xiàn)驚厥。
Mg2+與Ca2+ 化學(xué)性質(zhì)相似，可以特異地競爭Ca2+受點(diǎn)，拮抗Ca2+的作用，抑制神經(jīng)化學(xué)傳遞和骨骼肌收縮，從而使肌肉松弛。過量時，引起呼吸抑制、血壓驟降以致死亡�？诜蛩徭V則不易吸收，導(dǎo)致腸道內(nèi)的高滲狀態(tài)，阻止腸內(nèi)水分的吸收，引起容積性導(dǎo)瀉作用。
實(shí)驗(yàn)采用給藥途徑的不同，用于小鼠體內(nèi)觀察藥物作用的差異。即本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同給藥途徑給予相同劑量的尼可剎米后引起小鼠藥理作用出現(xiàn)量的變化，及不同給藥途徑給予相同劑量的硫酸鎂后www.med126.com引起小鼠藥理作用出現(xiàn)質(zhì)的差異，了解不同給藥途徑對藥物作用起效時間及作用強(qiáng)度和性質(zhì)的影響，深刻理解影響藥物作用的因素和合理用藥的相關(guān)知識。
【實(shí)驗(yàn)對象】
小鼠5只，體重20 ~30 g，雌雄不拘。
【實(shí)驗(yàn)藥品與器材】
2%尼可剎米溶液，5％硫酸鎂溶液。
1ml注射器、針頭、小鼠灌胃針頭、鼠籠、普通天平。
【實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)】
動物活動變化、呼吸頻率、幅度、反射活動變化、震顫、驚厥及死亡時間等。
【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】
（1)取健康小鼠3只，稱體重后分別作標(biāo)記，然后觀察正常活動情況，再依次給予尼可剎米，并密切觀察小鼠反應(yīng)。
甲鼠以灌胃法給予尼可剎米（4 mg／10 g)；乙鼠皮下注射尼可剎米（4 mg／10 g)；丙鼠腹腔注射尼可剎米（4 mg／10 g)。
每次給藥后立即記下當(dāng)時時間，并分別置于鼠籠中，密切觀察3只小鼠的反應(yīng)。
動物首次出現(xiàn)驚厥時，也立即記下時間，從給藥到首次出現(xiàn)驚厥的一段時間為藥物作用的潛伏期，記錄結(jié)果，并比較有何不同。
將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入表15-2中
表15-2 尼可剎米不同途徑給藥對小鼠驚厥潛伏期的影響
| 鼠號 | 體重(g) | 給藥量（ml) | 給藥途徑 | 潛伏期 | 最后結(jié)果 |
| 甲 乙 丙 |
（2)取家兔2只，稱體重后分別作標(biāo)記，然后觀察正�；顒忧闆r，再按下述方法分別給予硫酸鎂溶液，并密切觀察家兔反應(yīng)。
甲兔通過灌胃給予5％硫酸鎂溶液800mg／kg體重，乙兔耳緣靜脈注射5％硫酸鎂溶液175mg/kg體重。分別置于兔籠中，觀察2只家兔表現(xiàn)，記錄結(jié)果，并比較有何不同。
當(dāng)家兔出現(xiàn)明顯呼吸抑制時，迅速耳緣靜脈注射2.5％CaCl2溶液2mg/kg體重，觀察癥狀的變化。
將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入表15-3中
表15-3 硫酸鎂不同給藥途徑對藥物效應(yīng)的影響
| 鼠號 | 體重(g) | 劑量 | 給藥途徑 |
肌張力 呼吸 肌張力 呼吸 | CaCl2 解救結(jié)果 |
| 甲 乙 |
【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】
（1)給小鼠灌胃時，動作要輕柔，以免損傷口腔及食道粘膜。
（2)表“15-2”最后結(jié)果欄記錄是否死亡以及從給藥高死亡相隔時間。
【思考題】
不同給藥途徑在哪些情況下使藥物的作用產(chǎn)生質(zhì)的不同?在哪些情況下則使藥物的作用只產(chǎn)生量的不同？為什么？
（郭紫芬 謝志忠)
第三節(jié) 磺胺類血漿藥物濃度半衰期測定
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/b>】
（1)掌握t1/2比色測定法。
（2)了解藥物血漿t1/2、生物利用度和表觀分布容積等概念。
（3)學(xué)會繪制藥物時—量曲線。
【實(shí)驗(yàn)原理】
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血漿藥物濃度半衰期是指血漿藥物濃度下降一半所要的時間。臨床上多數(shù)藥物在體內(nèi)按一級代謝動力學(xué)的規(guī)律而消除，也就是血漿中藥物消除速率與瞬時藥物濃度成正比，根據(jù)這一規(guī)律可知：藥物靜脈注射后，如以血漿藥物濃度的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，其時量關(guān)系常呈直線。
該直線的方程式為： ①
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藥物血漿濃度半衰期（t1/2)為： ②
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因此，我們只要求出藥物的消除速率常數(shù)Ke，就可以得出藥物的血漿半衰期。
由公式（1)可推出 ③
只要我們測出消除相任意兩個時間的血漿藥物濃度，又知道這兩個濃度變化的時間間隔，就可以求出Ke，進(jìn)一步可計算出血漿藥物濃度的半衰期。
以臨床上常用的抗菌藥——磺胺類藥物為例：磺胺類藥物在酸性溶液中，可使苯環(huán)上的氨基（-NH2)離子化生成銨類化合物（-NH3+)，進(jìn)而與亞硝酸鈉起重氮反應(yīng)，產(chǎn)生重氮鹽（-N=N+-)。此重氮鹽在堿性溶液中與酚類化合物如麝香草酚起偶聯(lián)反應(yīng)，生成橙紅色的偶氮化合物，由此可見，偶氮染料的顯色深淺與磺胺的濃度有關(guān)。故可用分光光度計測出其光密度，通過與標(biāo)準(zhǔn)品光密度的比較及運(yùn)算，即可推算出磺胺的濃度。
具體反應(yīng)方程式如下：
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計算公式如下：
【實(shí)驗(yàn)對象】
家兔，體重2～3kg，雌雄不拘。
【實(shí)驗(yàn)藥品與器材】
723型分光光度計、離心機(jī)、手術(shù)器械一套、注射器、2號注射針頭、動脈插管、動脈夾、微量定量移液器、試管架、大號試管、吸管、洗耳球。
3％戊巴比妥鈉、125單位/ml 肝素生理鹽水、20％磺胺嘧啶鈉（SD)、6％三氯醋酸、0．5％亞硝酸鈉、0．5％麝香草酚氫氧化鈉溶液。
【實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)】
吸光度值。
【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。
（1)SD標(biāo)準(zhǔn)液配制
a．取20％SD溶液2.56 ml置于200 ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，此濃度即256 mg／100m1。
b．取上述濃度為256mg／100 m1 SD溶液100ml倍比稀釋，分別獲得128 mg／100 m1、64 mg／100 m1、32 mg／100 m1、16 mg／l00 m1、8 mg／100 m1 SD溶液。
（2)取試管7支，編號。每支試管內(nèi)加6％三氯醋酸7.8ml，再分別加入不同濃度的SD標(biāo)準(zhǔn)液０.2 m1(6支內(nèi))，另1支加入0.2mI蒸餾水。貼上標(biāo)簽、混勻。
（3)再取試管7支，編號。按表15-4依次加入各種溶液后充分搖勻。
表15-4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
| 7 空白 | 6 （8 mg/ 100 ml) | 5 (16 mg/ 100 ml) | 4 (3 2mg/ 100 ml) | 3 (64 mg/ 100 ml) | 2 (128 mg/ 100 ml) | 1 (256mg/100 m1) | |
| ②步中標(biāo)準(zhǔn)液（ml) ②步中蒸餾水（ml) 0.5%亞硝酸鈉（ml) 0.5%麝香草酚（ml) | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 |
（4)用723型分光光度計比色，選擇520nm波長，讀出各試管光密度。
（5)以SD濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、血標(biāo)本制備
取家兔一只，稱重，3％戊巴比妥鈉1 ml／kg耳緣靜脈注射麻醉，將麻醉后家兔固定于兔手術(shù)臺上，施頸部切開術(shù)，分離頸總動脈并插管以備取血標(biāo)本時用。耳緣靜脈注射0.5％肝素1 m1／kg，5分鐘后放血0.5 m1，同時注入20％SD溶液2 m1／kg。分別于給藥后的第0、5、10、20、30、40、60分鐘時放血0.5 m1。
取離心管8支，加入6％三氯醋酸7.8m1，然后從0.5m1各血樣本中準(zhǔn)確吸取0.2ml于離心管，混勻，離心(1500轉(zhuǎn)，5分鐘)，分別取上清液于另外8支試管中，待用。
3、 比色測定
按表15-5依次加入各種溶液后充分搖勻。用723型分光光度計進(jìn)行比色，選擇520nm波長，以空白管調(diào)零，讀出吸光度(A)值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出藥物的相應(yīng)血藥濃度。將結(jié)果填入表15-6
表15-5 SD顯色反應(yīng)體系
| 空白管 | 待測管 | |
| 1 2 3 4 5 6 7 | ||
| 給藥前上清液(m1) 給藥后上清液(m1) 0.5％亞硝酸納(m1) 0.5％麝香草酚(m1) | 3 1 2 | 3 1 2 |
表15-6 給藥后不同時間兔血SD濃度
| 0′ | 5′ | 10′ | 20′ | 30′ | 40′ | 60′ | |
| 光密度(A) 濃 度(C) 濃度對數(shù)(lgC) |
4、以時間為橫坐標(biāo)，血藥濃度的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制t—lgc曲線。
5、計算
|
t1/2=
|
（2)按下式計算表觀分布容積：Vd =
|
【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】
1．給SD時一定要注入靜脈內(nèi)，若注射至皮下將會影響t1／2測定。
2．每次取血前先將插管中殘血放掉。
3．每吸取一個血樣時，必須更換吸嘴。
4. 表8－4中操作程序不得顛倒，每次加試劑后必須混勻后方可加入下一種試劑。
5．采血時間不準(zhǔn)時，應(yīng)記錄實(shí)際時間。
6．血液加到裝三氯醋酸試管內(nèi)立即搖勻，否則易出現(xiàn)凝血塊。
【思考題】
1．試述t1／2、Vd、F的定義和意義。
2. 計算血漿藥物濃度半衰期時是否是從t—lgc曲線上任意取兩點(diǎn)?
3．某藥的最低有效血濃度為2.0 mg/100 m1，t1／2為10.7小時。測得患者血藥濃度4.7 mg/100 m1，試問尚能保持有效濃度幾小時？（計算公式Ct＝Co×0.5t/t1 / 2)
（郭紫芬 廖端芳)
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