實(shí)驗(yàn)二十一 螺旋體
螺旋體(spirochete)是一類細(xì)長柔韌、彎曲呈螺旋狀、具有軸絲、運(yùn)動(dòng)活潑的原核細(xì)胞型微生物。用革蘭染色法染色時(shí)不易著色。螺旋體種類多，除鉤端螺旋體(簡稱鉤體)外皆不易在人工培養(yǎng)基上生長。大多數(shù)為非致病性螺旋體，僅少數(shù)對(duì)人和動(dòng)物有致病性。對(duì)人類致病的主要有鉤體(圖21-1)、梅毒螺旋體(圖21-2)、回歸熱螺旋體(圖21-3)和伯氏疏螺旋體。
圖21-1 鉤端螺旋體屬鏡下形態(tài)(暗視野) 圖21-2 梅毒螺旋體鏡下形態(tài)(暗視野)
圖21-3 回歸熱螺旋體鏡下形態(tài)(Giemsa染色)
一、鉤端螺旋體
（一)形態(tài)觀察
【材料與方法】
鉤體暗視野顯微鏡觀察 取鉤體培養(yǎng)液，滴于載玻片上，覆以蓋玻片。在暗視野顯微鏡聚光器上加1滴香柏油，使載玻片背面與油接觸，低倍鏡下調(diào)動(dòng)反光鏡，使光集中在聚光器上，調(diào)清楚視野再換高倍鏡觀察。
【結(jié)果】
1．藥品數(shù)據(jù)在黑色背景中可清楚地見到閃爍光亮的螺旋體，一端或兩端彎曲呈鉤狀，運(yùn)動(dòng)活潑。
2．鍍銀染色深，鉤體染成棕色，菌體粗，有鉤，細(xì)密螺旋不明顯。
（二)人工培養(yǎng)
鉤體人工培養(yǎng)較容易，常用柯索夫(Korthof)培養(yǎng)基。在含10%～20%的兔血清培養(yǎng)基中生長良好。溫度以28℃左右為宜。一般pH7.2～7.4。需氧。
【材料與方法】
1．取發(fā)病1～7d內(nèi)患者血2～3ml。
2．接種于2～3支柯索夫液體培養(yǎng)基，接種時(shí)，血2～3滴/支，血量與培養(yǎng)液成1∶1～20為宜，置28℃培養(yǎng)。
3．從第3d起，每天或數(shù)天檢查1次。
【結(jié)果】
7～10d為鉤體繁殖高峰，鉤體生長良好者，液體呈霧狀渾濁，輕搖培養(yǎng)基,有絮狀物泛起。若培養(yǎng)1個(gè)月仍無鉤體生長則為陰性。
（三)凝集溶解試驗(yàn)
【原理】
凝集溶解試驗(yàn)即活抗原顯微鏡凝集溶解試驗(yàn)，是目前用得最多的鉤體血清學(xué)試驗(yàn)之一。鉤體與相應(yīng)抗體結(jié)合而發(fā)生凝集，抗體濃度高時(shí)，可使凝集又發(fā)生溶解，故名凝集溶解試驗(yàn)。本試驗(yàn)有型特異性和較高敏感性，可用于臨床診斷、鉤體血清型鑒定和流行病學(xué)調(diào)查。
【材料與方法】
1．在有機(jī)玻璃凹孔板上，2h后，將各孔分別取1滴于載玻片上，覆以蓋玻片，在暗視野顯微鏡下觀察鉤體凝集溶解情況(表21-1)。
表21-1 活抗原顯凝試驗(yàn)操作方法(定量法)(單位：ml)
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凹孔編號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
血清稀釋度 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 對(duì)照
稀釋血清量 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 鹽水0.1
抗原(鉤體培養(yǎng)物)0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
血清最終稀釋度1:1001:200 1:400 1:800 1:醫(yī)學(xué).全在線m.f1411.cn1600 1:3200 1:6400 1:128001:25600 1:51200 －
搖勻，置37℃2h
假定結(jié)果 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ ++ + － － －
【結(jié)果】
結(jié)果判斷如下：
++++ 幾乎全部鉤體溶解，呈團(tuán)塊狀或大小不等的殘片，間或有少數(shù)游離的鉤體存在。
+++ 約75％以上的鉤體凝集，呈塊狀或蜘蛛狀，約25%鉤體游離。
++ 約50％鉤體凝集，呈小蜘蛛狀，約50%鉤體游離。
+ 約25％鉤體凝集，75%鉤體游離。
- 全部鉤體正常，分散，無凝集。
能使抗原發(fā)生凝集溶解(++)的血清最高稀釋度作為血清抗體效價(jià)。病人單份血清效價(jià)超過l:400，或雙份血清的第2份較第1份有4倍以上增長者，有診斷意義。
二、梅毒的血清學(xué)試驗(yàn)
梅毒的血清學(xué)試驗(yàn)根據(jù)所用抗原不同可分兩類。第一類是非螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)，用正常牛心肌類脂作抗原，檢測(cè)非特異性的反應(yīng)素。這一類試驗(yàn)主要有以純心磷脂、卵磷脂為抗原的方法，即性病研究實(shí)驗(yàn)方法(VDRL)及其改良法即血清不加熱的反應(yīng)素試驗(yàn)(unheated serum reagin test，USR)和快速血漿反應(yīng)素紙片試驗(yàn)(rapidplasma reagin，RPR),有商品試劑供應(yīng)。USR、RPR法的特異性、敏感性較好，且簡便快速，容易在一般實(shí)驗(yàn)室推廣使用，故最常用于梅毒的普查、篩選，并作為梅毒感染的標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)診斷方法。第二類為螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)，是以死的或活的梅毒螺旋體或其成分為抗原檢測(cè)特異性的抗梅毒螺旋體抗體，即熒光螺旋抗體吸附(fluorescenttreponemal antibody-absorption。FTA-ABS)試驗(yàn)和螺旋體制動(dòng)試驗(yàn)(treponemal immoblization test，TPI)。第二類試驗(yàn)雖然特異性、敏感性都高，但試驗(yàn)復(fù)雜，不易推廣，主要用于疑難病例的診斷和鑒別生物學(xué)假陽性。
（一)血清不加熱的反應(yīng)素試驗(yàn)(USR)
【原理】
一般認(rèn)為梅螺旋體感染后，機(jī)體組織被破壞而裂解出一種類脂成分，并與梅毒螺旋體蛋白質(zhì)結(jié)合成類脂蛋白復(fù)合物，刺激機(jī)體產(chǎn)生反應(yīng)素，這種反應(yīng)素可與牛心肌類脂發(fā)生反應(yīng)。
【材料】
1．抗原 USR試劑(商品試劑)，置3～10℃可保存6個(gè)月。
2．玻片 在玻片上用油漆畫直徑為14mm圓圈數(shù)個(gè)。
3．1ml注射器、平面針頭：45滴/ml。
4．待檢血清標(biāo)本，不必滅活。
【方法】
1．玻片定性試驗(yàn)
(1)取待檢血清0.05ml加在玻片圓圈內(nèi)。
(2)用1ml注射器加上專用針頭，吸取USR試劑后垂直加入，每份標(biāo)本1滴。
(3)手搖或震蕩器搖動(dòng)玻片4min，每分鐘搖動(dòng)180次左右，在3min內(nèi)觀察完畢。可肉眼直接觀察或顯微鏡觀察。
2．玻片定量試驗(yàn) 將原血清作倍比稀釋，從1∶2至1∶64，按定性方法操作。
【結(jié)果】
++++～+++ 肉眼可見大的或較大的塊狀物。
++ 可見小塊狀物，懸液清亮。
+顯微鏡下為小塊狀物，均勻分布。
±顆粒不規(guī)則分布，或呈細(xì)小粗糙物。
-顆粒細(xì)小，分布均勻。
（二)快速血漿反應(yīng)素紙片試驗(yàn)(RPR)
本法是USR的改良法，除具備USR的優(yōu)點(diǎn)外，患者血清、血漿均可用于試驗(yàn)，由于RPR試劑中加入高純度的膠體炭，可與陽性血清發(fā)生黑色凝塊，所以不用顯微鏡就能準(zhǔn)確判斷結(jié)果。
【材料】
1．抗原 RPR試劑(商品試劑)。
2．RPR試驗(yàn)紙片 每張有12個(gè)圈。
3．待檢血清標(biāo)本或血漿標(biāo)本，不必滅活。
4．1ml注射器，平面針頭，60滴/ml。
5．轉(zhuǎn)動(dòng)器平面轉(zhuǎn)動(dòng)，100次/min，轉(zhuǎn)動(dòng)所形成的圓圈直徑約2cm。
【方法】
1．血清定性試驗(yàn)
(1)吸取待檢血清或血漿0.05ml加在紙板圓圈中，并擴(kuò)展到整個(gè)圓圈。
(2)將RPR懸液搖勻，用注射器吸取后于每個(gè)標(biāo)本上加1滴。
(3)用轉(zhuǎn)動(dòng)器或手轉(zhuǎn)動(dòng)紙板8min，為防止蒸發(fā)，可在紙板上加蓋。
(4)立即在明亮的光線下用肉眼觀察結(jié)果。為了更好地區(qū)分弱陽性與陰性結(jié)果，將紙板傾斜與水平面成30°角，作順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，使血清與抗原在圓圈內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)，可更清楚地觀察反應(yīng)，必要時(shí)可借助于放大鏡。
2．血清定量試驗(yàn) 定性試驗(yàn)陽性和弱陽性者，都必須做定量試驗(yàn)。方法是將血清用生理鹽水作對(duì)倍稀釋，從1∶2至1∶32按定性試驗(yàn)操作。若效價(jià)高于1∶32，則應(yīng)測(cè)1∶64、l∶128、1∶256稀釋度。以最高稀釋度達(dá)到陽性或弱陽性反應(yīng)作為效價(jià)。
【結(jié)果】
陽性反應(yīng)：可見中等或大凝集塊。
弱陽性反應(yīng)：可見小凝集塊。
陰性反應(yīng)：無塊狀物或極少數(shù)顆粒聚集成粗糙物。
【注意事項(xiàng)】
1．本試驗(yàn)在23℃～29℃室溫進(jìn)行，氣溫過低或過高都可能影響反應(yīng)性。試劑及待檢血清從冰箱取出后也應(yīng)在23℃～29℃處放置30min再做試驗(yàn)。
2．作為輔助診斷，試驗(yàn)結(jié)果必須結(jié)合臨床病史、體征、治療史和流行病學(xué)情況進(jìn)行綜合判斷。
3．應(yīng)排除某些疾病引起的生物學(xué)假陽性和技術(shù)性誤差引起的假陽性。生物學(xué)假陽性的效價(jià)一般不超過1∶8。
4．臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)設(shè)陰、陽性對(duì)照。
