三、分子克隆化的另一些酶
�。ㄒ�)DNA聚合酶
�。―Na polymerase)的作用是將1個脫氧三磷酸核苷酸加到引物（primer)的3’-OH上，釋放出一個焦磷酸分子（ppi)，如下式表示。
聚合酶主要有以下幾種：
1．大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ 大腸桿菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase)主要有3種作用：①5’→3’的聚合作用。但不是復(fù)制染色體而是修補DNA，填補DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中摻入的錯誤核苷酸。③5’→3’外切酶活性。切除受損傷的DNA。它在切口平移（nick translation)中的應(yīng)用，將在下面介紹。
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一個片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。它可用于填補DNA單鏈末端成為雙鏈。如果供給32P標(biāo)記的三磷酸核苷酸，則可使DNA帶上同位素標(biāo)記。當(dāng)用交錯切割的限制酶切成帶有單鏈粘性末端的DNA片段，要用被切成平頭末端的DNA片段連接時，可以先用Klenow片段使粘性末端的單鏈補齊成為平頭，然后在DNA連接酶作用下把兩個DNA片段連接起來。
另外還有大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ。前者不能利用單鏈DNA或poly(dA-dT)為模板。需有鎂離子和dNTP時才能表現(xiàn)出酶活性，無自發(fā)合成DNA的作用。后者沒有5’→3外切酶活性，也不能用單鏈DNA作為模板。
2．噬菌體DNA聚合酶 這里以T4DNA聚合酶為例。它也具有5’→3聚合酶活性，但它的外切酶活性比大腸桿菌的要高200倍。因此，它也可用來補齊單鏈末端或標(biāo)記同位素。
�。ǘ�)RNA聚合酶
RNA聚合酶（RNa polymerase)的作用是轉(zhuǎn)錄RNA。有的RNA聚合酶有比較復(fù)雜的亞基結(jié)構(gòu)。如大腸桿菌RNA聚合酶有四條多肽鏈，另有一個促進新RNA分子合成的σ因子，因此它的組成的是α2ββσ。這種結(jié)構(gòu)稱為全酶（holoenzyme),除去了σ因子的酶稱為核心酶。噬菌體RNA聚合酶則沒有亞基。
真核生物的RNA聚合酶分三類。RNA聚合酶Ⅰ存在于核仁中，轉(zhuǎn)錄rRNA順序。RNA聚合酶Ⅱ存在于核質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄大多數(shù)基因，需要“TATA”框。RNA聚合酶Ⅲ存在于核質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄很少幾種基因如tRNA基因如5SrRNA基因。有些重復(fù)順序如Alu順序可能也由這種酶轉(zhuǎn)錄。上面提到的“TATA”框又稱Goldberg –Hogness順序，是RNA聚合酶Ⅱ的接觸點，是這種酶的轉(zhuǎn)錄單位所特有的。它在真核生物的轉(zhuǎn)錄基因的5’端一側(cè)，在轉(zhuǎn)錄起點上游20至30個核苷酸之間有一段富含AT的順序。如以轉(zhuǎn)錄起始點為0，則在-33到27個核苷酸與-27至21核苷酸之間，有一個“TATA”框。一般是7個核苷酸。RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄單位的典型結(jié)構(gòu)如圖23-2。原核生物中也類似“TATA”框的結(jié)構(gòu)。RNA聚合酶作用在“TATAAT”（Pribnow)盒和“TTGA－CA”框附近。
圖23-2 反轉(zhuǎn)錄酶的作用機理
（三)反轉(zhuǎn)錄酶
反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcripatase)是以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA（cDNA)的酶。哺乳類C型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶和鼠類B型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄酶則由兩上亞基結(jié)構(gòu)。真核生物中也都分離出具有不同結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄酶。這種酶需要鎂離子或錳離子作為輔助因子，當(dāng)以mRNA為模板時，先合成單鏈DNA（ssDNA)，再在反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下，以單鏈DNA為模板合成“發(fā)夾”型的雙鏈DNA（dsDNA)，再由核酸酶S1切成二條單鏈的雙鏈DNA。因此，反轉(zhuǎn)錄酶可用來把任何基因的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA拷貝，然后可大量擴增插入載體后的cDNA。也可用來標(biāo)記cDNA作為放射性的分子探針。
