四、蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的最適穩(wěn)定量及標(biāo)記的最佳pH值被確定以后便可進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下：
（1)根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金的總量計(jì)算出所需要的待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量。
�。�2)在電磁攪拌下，將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中（pH已調(diào)至PI超過(guò)0.5pH)，加入蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)逐滴加入，1mg的蛋白質(zhì)大約5min加完。
（3)在磁性攪拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA)使其終濃度為1%，或加入3%聚乙二醇（PEg MW20000)使其終濃度為0.05%, 我們對(duì)比了BSA和PEG穩(wěn)定膠體金的效果，BSA穩(wěn)定的標(biāo)記膠體金，放在4℃達(dá)2年半仍然保持良好性能，而用PEG穩(wěn)定的標(biāo)記膠體金放在4℃1年左右就有分層現(xiàn)象，而且染色效果顯著下降。因此，我們認(rèn)為最好還是用BSA作穩(wěn)定劑。
�。�4)將標(biāo)記好的膠體金裝入透析袋中，兩頭扎緊，放入蔗糖或硅膠中濃縮，濃縮到原體積的1/10量，濃縮完畢后純化。離心法純化時(shí)，不要濃縮。
五、膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的純化
標(biāo)記好的免疫金探針必須經(jīng)過(guò)純化處理以后才能用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色。純化的目的是除去其中未標(biāo)記的蛋白質(zhì)，未充分標(biāo)記的膠體金以及在標(biāo)記過(guò)程中可能形成的各種聚合物。
�。ㄒ�)調(diào)整與超速離心法
�。�1)將標(biāo)記的大于10nm的膠體金溶液選用15000r/min 4℃離心15min，吸出上清，棄去沉淀，以去除大的聚合物。
�。�2)一般在10nm以上所標(biāo)記的膠體金均可在調(diào)整離心機(jī)上離心，小于10nm顆粒的膠體金用超速離心機(jī)離心，在4℃離心1h左右，棄上清，將沉淀以原體積的0.02mol./l TBSpH8.2（內(nèi)含1%BSA，0.05%疊氮鈉)溶解，重復(fù)離心2～3次，沉淀溶于原體積的1/10TBS中。4℃保存?zhèn)溆�。為了得到顆粒均勻一致的免疫金試劑，上述粗提制劑可用10%～30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度離心，分帶收集不同大小顆粒的膠體金標(biāo)記蛋白制劑。
幾種免疫金探針離心所用轉(zhuǎn)速（見(jiàn)表5-6)，離心純化時(shí)所用轉(zhuǎn)速見(jiàn)表5-7，膠體金的OD值見(jiàn)表5-8。
表5-6 幾種免疫金探針離心時(shí)所用轉(zhuǎn)速參考表
| 膠體金顆粒直徑（nm) | 蛋白質(zhì) | 時(shí)間（min) | 轉(zhuǎn)速（r) |
| 3.0 | GAR IgG | 60 | 30000 |
| 5.0 | GAR IgG | 50 | 25000 |
| 10.0 | RAM IgG | 50 | 19000 |
| 15.0 | SPA | 40 | 17000 |
| 15.0 | ALcc IgG | 40 | 17000 |
| 20.0 | SPA | 40 | 13000 |
| 25.0 | SPA | 35 | 12000 |
說(shuō)明：GAR IgG=羊抗兔IgG；RAm IgG=兔抗鼠IgG；ALcc IgG=抗肝細(xì)胞癌IgG; SPA=葡萄球菌A蛋白
表5-7 幾種免疫金探針離心純化時(shí)所用轉(zhuǎn)速
| 膠體金顆粒（nm) | pH | 蛋白質(zhì) | 轉(zhuǎn)速（xg) | 時(shí)間（min) |
| 5 | 9.0 | 羊抗人IgG | 45000 | 45 |
| 10 | 8.2 | 抗胃癌單克隆抗體 | 45000 | 30 |
| 15 | 6.5 | 鏈霉親和素 | 12000 | 45 |
| 20 | 6.0 | SPA | 12000 | 30 |
將純化好的膠體金用0.02mol/l TBS緩沖液作1：20稀釋，用520nm測(cè)OD值。
表5-8 不同大小膠體金的OD值
| 膠體金顆粒大�。╪m) | OD（520)nm |
| 5 | 2.5 |
| 10 | 2.5 |
| 15 | 3.5 |
| 20 | 5.0 |
