�。�3)免疫染色
①切片（厚50～70nm)貼在金網(wǎng)或覆有碳膜的鎳網(wǎng)上。所有下列步驟在室溫、濕盒內(nèi)進行。所有溶液需經(jīng)微孔濾紙（0.25～0.45μm)濾過。
②正常羊血清30min。
③第一抗血清（PBS稀釋)，37℃2h。
�、芸捎脽ǎɑ蛩芰蠅貒娤捶�)，以鑷夾鎳網(wǎng)在第一燒杯中洗蕩30min，然后在第二燒杯中洗蕩1h 。
�、菡Ｑ蜓�30min。
�、薜诙寡澹z金標記抗體)以正常羊血清稀釋為1：1，以鎳網(wǎng)置于血清滴上孵育1h。
⑦沖洗如④。
⑧覆于2%OSO4水溶液上，30min。
�、釠_洗如④。
⑩干燥后在電鏡下觀察。
�。�4)Lowicryl K4M快速包埋染色法（Altman等1984)
�、侔駝┑呐渲疲簡� 體13g
交聯(lián)劑2g
引發(fā)劑75mg
�、谏飿悠诽幚恚撼司酆线@一步驟外，下列所有步驟都在20℃進行。
1)組織用3%戊二醛—3%多聚甲醛磷酸緩沖液，pH7.4,在20℃固定1～2h。用磷酸緩沖液清洗后進行脫水。
2)脫水：在50%、75%和90%的雙甲基甲酰胺（Dimethylformamde,DMF)內(nèi)系列脫水，每步10min。
3)浸透：Lowicryl K4M:DMF=1:2 10min
Lowicryl K4M:DMF=1:1 15min
100% Lowicryl K4M 20min
100% Lowicryl K4M 25min
4)包埋與聚合：組織移入裝滿K4M的膠囊中，以紫外線燈照射聚合（紫外線燈條件同上)，燈和組織距離10cm,4℃照射45min，組織塊在室溫進行超薄切片（切片時水槽內(nèi)水面應略低以防浸濕組織塊的切面)。
5)以覆有碳膜的鎳網(wǎng)撈取切片。
6)免疫染色。
整個包埋時間僅需4～5h。
Lowicryls 應保存在暗處，-4℃，該物質有刺激性，在配制時應戴手套，以免觸及皮膚。在通風櫥內(nèi)操作，以免蒸氣刺激眼睛。如觸及皮膚和眼睛，應立即以水沖洗局部，氧化重金屬如KmnO4能與包埋劑作用而影響染色效果，以不用為佳。
2．LR White 和Lr gold 是一種混合的丙烯酸單體的透明樹脂，具有極低的粘度（8cps)和較強的嗜水性，因此有較強的穿透性，有利于抗體（或抗原)和免疫化學物質穿過LR樹脂，達到組織結合部位。在免疫細胞化學的光鏡（半薄切片)和電鏡水平應用都具有良好效果。標本脫水至70%乙醇即可，能較好地保持抗原性。Lr white和Lr gold在國外提供廠家有 Poly－sciences INC等，Lr gold是一種光引發(fā)低發(fā)低溫聚合的包埋劑，對于免疫細胞化學特別適用，能最大限度地保持組織的抗原與抗體活性，其最佳光聚合溫度在-25℃，在聚合后呈現(xiàn)金黃色，因而得名。Lr white可在熱和冷兩種情況下聚合，熱聚合在60℃，24h，冷聚合在-25℃，需加加速劑（accelerator)調(diào)整配制比例。生物樣品處理與免疫染色等同常規(guī)樹脂切片。
3．GMA 是乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycol Methacrylate 即2—hydroxyethyl methacrylate, HEMA)的縮寫。遠在60年代，電鏡工作者就試圖將其作為生物包埋劑應用于光鏡和電鏡。GMA作為電鏡包埋劑的優(yōu)點是電子密度大，影像反差好。但存在三個主要缺點：一是包埋聚合后的組織塊很脆，不易修整和切片。二是聚合過程中易造成組織損傷如人為的細胞器腫脹。三是缺乏穩(wěn)定性，不能承受電子束的轟擊，包埋劑遇熱升華，造成組織塌陷變形。故后來為環(huán)氧樹脂所取代。聚合后的環(huán)氧樹脂有良好的塑料穩(wěn)定性，能承受電子束的轟擊不變形，而且影像反差好，分辨率高，但其半薄切片染色不夠滿意始終是個有待解決的問題。而GMA包埋切片的染色效果明顯優(yōu)于環(huán)氧樹脂。于是電鏡工作者如Leduc和Bernhard（1986)嘗試以增加一定比例的增塑劑如甲基丙烯酸酯和少量水外，并加入適量的增塑劑如聚乙二醇400（PEG400)以改變其硬度，加入適量的聞聯(lián)劑乙烯二甲基丙烯酸酯（ethylene dimethacrylate)以增強其抗電子束轟擊的穩(wěn)定性。為避免聚合時過快，產(chǎn)生高溫，損傷組織結構，選用低溫型引發(fā)劑—過氧化苯甲酰（Benzoyl Peroxide)，溫度范圍-10℃～-30℃。經(jīng)過不斷的配制改進，現(xiàn)GMA已廣泛應用于半薄切片（1～3μm)的光鏡觀察，特別是組織化學方面的研究和電鏡水平的免疫細胞化學技術。現(xiàn)將GMA包埋劑的配制、生物樣品處理和電鏡水平的免疫細胞化學染色方法簡介如下：
�。�1)GMA單體溶液在出廠時都加有氫醌類穩(wěn)定劑，用前須以每25ml單體溶液加一匙活性碳，在振蕩器上振蕩5min，過濾以除去氫酯，以免影響聚合。
�。�2)包埋劑的配制：
a. 100% GMA 66.5ml
N—甲基丙烯酸丁酯 28.5ml
5%乙烯二甲丙烯酸酯 5.0ml
1.5 %過氧體苯甲酰 1.0g
1.0%PEG 400 1.0ml
b.A液：
GMA單體液 90ml
PEG 400 5～9.4ml
過氧化苯甲�！ �0.2～0.69g
攪拌溶解后置棕色瓶內(nèi)； 4℃保存。
B液：
PEG 400 20ml
二甲基苯胺 1ml
應用時A：B按10：1比例充分混合（張承志等1986)。
�。�3)生物樣品處理：組織固定可用PLP液或1%戊二醛溶液（磷酸緩沖液配制，pH7.4)。經(jīng)系列酒精脫水至新鮮的GMA單體溶液中浸24h。以上步驟可在室溫或4℃進行。
（4)包埋聚合：組織移入盛潢包埋液的膠囊內(nèi)，先放在真空泵內(nèi)以去除包埋液中的氣泡，然后在4℃，以紫外線燈（波長360nm)在距膠囊底部10～20cm處進行照射12～16h，以手指捏膠囊試其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，將膠囊丟入熱水中以去除膠囊外殼。
（5)切片貼在鎳網(wǎng)上，按PAg技術進行包埋染色，其區(qū)別于EPON包埋劑者，在于GMA包埋切片染色所需時間較短，在第一抗血清中，GMA室溫只需孵育1h，而EPON包埋切片需16～20h；在第二抗血清，即Pag 復合物中室溫30min，而EPON包埋切片需1h。鈾、鉛雙染后，電鏡觀察。
低溫包埋劑常用于鐵蛋白或膠體金免疫電鏡技術的包埋后染色。能檢出應用環(huán)氧樹脂包埋難以檢出的多種抗原。
四、對照試驗
為確定方法的特異性，免疫電鏡技術也需進行對照試驗（同第一章 )。
總之，不論哪一種免疫電鏡技術都面臨微細結構的保存和組織中抗原活性的保存這一對矛盾，如戊二醛、鋨酸等固定液有利于微細結構的保存，但對抗原活性有影響，而H2O2能增加樹脂穿透性，但對微細結構有損傷，能使反應部位產(chǎn)生孔洞。在生物樣品處理過程中，應同時注意到這兩個方面。其次，每次免疫染色中的清洗工作應注意徹底，否則非特異性產(chǎn)物和其他污染物會影響特異性反應產(chǎn)物的顯示和觀察。根據(jù)作者經(jīng)驗，以塑料水壺加錐形噴水頭噴洗，與鎳網(wǎng)面成平行方向，即順網(wǎng)面噴洗，較之目前通用的杯水洗滌法易于達到清潔目的。沖洗的殘留水滴以濾紙吸干時，應注意不要觸及載網(wǎng)本身。可將濾紙剪成三角形，以尖端接觸水滴，即可達到吸干水份的目的，整個過程中，必須應用雙蒸水，容器應專用。
