(2)C-末端分析
A.肼解法：這是測定C-末端最常用的方法。將多肽溶于無水肼中，100℃下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果羧基末端氨基酸以游離氨基酸狀釋放，而其余肽鏈部分與肼生成氨基酸肼。
這樣羧基末端氨基酸可以采用抽提或離子交換層析的方法將其分出而進(jìn)行分析。如果羧基末端氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)菐в絮０啡?a class="channel_keylink" href="/pharm/2010/20101030182339_335626.shtml" target="_blank">天冬酰胺和谷氨酰胺，則肼解時(shí)不能產(chǎn)生游離的羧基末端氨基酸。此外肼解時(shí)注意避免任何少量的水解，以免釋出的氨基酸混淆末端分析。
B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以專一性地水解羧基末端氨基酸。根據(jù)酶解的專一性不同，可區(qū)分為羧肽酶A、B和C。應(yīng)用羧肽酶測定末端時(shí)，需要事先進(jìn)行酶的動力學(xué)實(shí)驗(yàn)，以便選擇合適的酶濃度及反應(yīng)時(shí)間，使釋放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。
3)氨基酸組成分析
在進(jìn)一步分析多肽鏈的氨基酸順序之前，首先應(yīng)了解它是由那幾種氨基酸組成的，每種氨基酸有多少?分析組成的方法有：
①層析法
將多肽鏈完全酸水解成游離氨基酸，然后進(jìn)行Dansyl標(biāo)記，聚酰胺薄膜層析，此方法在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中是一種超微量的分析術(shù)，但此方法用于定量分析尚不夠準(zhǔn)確。
②離子交換層析法
Spaekman等發(fā)展了一種精確的氨基酸組分的定量方法。他們采用磺酸型的離子交換樹脂，這是一種高分子量的固體聚苯乙烯，帶有大量的功能基團(tuán)，磺酸基在低pH和低離子強(qiáng)度條件下，根據(jù)氨基酸的酸堿性，氨基酸帶正電，于是替換下樹脂上的Na+，借助靜電作用而結(jié)合到磺酸基上。
由于各種氨基酸在樹脂上的親和力不同，因此當(dāng)改變?nèi)芤簆H和離子強(qiáng)度，便可依次將它們洗脫下來而分開，并進(jìn)行定量測定。在此基礎(chǔ)上發(fā)展了氨基酸自動分析儀。隨著科學(xué)技術(shù)的日益進(jìn)展，氨基酸自動分析儀在樣品的用量，分離速度及檢測能力上也有了很大的提高。目前最好的儀器樣品分析量只要幾十Picomole,分析時(shí)間只要數(shù)十分鐘，而且計(jì)算全部自動化，給研究蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)帶來了極大的方便。
2.多肽鏈的降解
多肽鏈的氨基酸組成往往是比較復(fù)雜，因此直接分析多肽的氨基酸順序還是很困難的，多采用將多肽鏈進(jìn)一步降解成為更小的片段，然后再行分析。肽鍵的裂解是一級結(jié)構(gòu)研究工作中的重要問題，它要求裂解點(diǎn)少，選擇性強(qiáng)，而且反應(yīng)產(chǎn)率高，目前主要有化學(xué)法和酶解法兩類。
1)化學(xué)法
(1)溴化氰法 是最理想的化學(xué)方法，能選擇性斷裂甲硫氨酸所在的肽鍵
溴化氫化學(xué)降解法其優(yōu)點(diǎn)：
�、僖话愕鞍踪|(zhì)含甲硫氨酸較少，由此可獲得大片段
�、趯Ｒ恍詮�(qiáng)
�、郛a(chǎn)率高達(dá)80%以上
④作用條件溫和，在室溫中用幾到十幾小時(shí)即可。
(2)部分酸水解法
Sanger在分析胰島素的一級結(jié)構(gòu)中采用了此法，即用0.1N鹽酸在110℃或用6N鹽酸在37℃水解。這種部分酸水解的方法特異性不強(qiáng)，因此對大片段的蛋白質(zhì)和肽均不合適。
(3)羥胺法
這種方法近十年來開始受人注意，羥胺能專一性地裂解AsnGly的肽鍵，酸性條件下裂解Asn-Pro肽鍵。已用于某些蛋白質(zhì)的分析。
(4)N-溴代琥珀酰亞胺法
主要裂解Try處的肽鍵，五十年代研究較多。但由于它也能斷裂TyrHis肽鍵，因此應(yīng)用不廣。
