從Warren和Marshall在1983年報(bào)道從慢性活動(dòng)性胃炎病人胃粘膜中成功地培養(yǎng)出螺旋形細(xì)菌以來(lái),來(lái)自澳大利亞、英國(guó)、荷蘭及我國(guó)不少研究結(jié)果均表明,該菌與慢性胃淡及消化性潰瘍有密切關(guān)系,該菌為幽門螺桿菌(Helicobacterwww.med126.com pylorides,簡(jiǎn)稱Hp)。為了進(jìn)一步研究Hp的致病性、分布及來(lái)源,我們對(duì)1000例內(nèi)鏡檢查患者進(jìn)行Hp微生物學(xué)及組織病理學(xué)檢查,并對(duì)5只成年狗、10只分健康小白鼠及10只大白鼠進(jìn)行有關(guān)Hp的實(shí)驗(yàn)研究,旨在評(píng)估人與其它動(dòng)物胃粘膜中Hp陽(yáng)性率、臨率意義及與慢性胃病的關(guān)系。
1 材料和方法
1.1 臨床研究
本研究對(duì)象為有化道癥狀進(jìn)行內(nèi)鏡檢查的1027例住院及門診患者,經(jīng)篩選后對(duì)1000例資料完整病例進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),其中,男709例,女291例,年齡12歲~82歲,平均47.2歲,內(nèi)鏡或病理最后診斷為慢性淺表性胃炎518例,慢性萎縮性胃炎174例,胃潰瘍56例、胃癌47例,胃息肉12例,十二指腸潰瘍121例,十二指腸炎38例,食管炎28例,食管癌6例。病人禁食12h,清晨空腹按常規(guī)準(zhǔn)備后進(jìn)行內(nèi)鏡檢查,內(nèi)鏡用洗必泰和乙醇消毒,活檢鉗用同樣方法處理,每個(gè)病人除在病變部位活檢外,均在胃竇距幽門2cm范圍內(nèi)取2~3個(gè)活檢標(biāo)本,分為兩份,一份作細(xì)菌培養(yǎng)和雙相快速診斷,另一份作組織病理學(xué)檢查。
組織學(xué)檢查 活檢標(biāo)本在10%甲醛溶液中固定,然后按常規(guī)步驟制做病理切片。所有活檢病理切片均做蘇木-伊紅(HE)染色,126例同時(shí)做Warthin-Starth染色,部分病例還做了革蘭染色及電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)Hp者為陽(yáng)性,否則為陰性。
微生物學(xué)檢查 取新鮮標(biāo)本一塊,先在Hp選擇性血脂平板涂抹,然后將該標(biāo)本插入尿素酶快速診斷培養(yǎng)皿中,觀察其反應(yīng),陽(yáng)性者一般3min~15min即可在組織塊周圍出現(xiàn)紅色反應(yīng)環(huán)、反應(yīng)環(huán)出現(xiàn)的快慢與大小和組織塊內(nèi)含菌量的多少成正比。尿素酶試驗(yàn)后,將原組織塊取出放在作氧化酶測(cè)試的濾紙片上,3min~15min內(nèi)組織粘膜部分變黑色者為陽(yáng)性,表示有Hp存在,否則為陰性。組織塊變黑的快慢也與Hp量成正比。我們稱之為“雙快試驗(yàn)”,Hp對(duì)雙快試驗(yàn)均成陽(yáng)性反應(yīng)(雙相陽(yáng)性),有變形污染者尿素酶試驗(yàn)可呈陽(yáng)性,而氧化酶試驗(yàn)陰性,假單胞菌屬污染則尿素酶試驗(yàn)陰性,而氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性,反以“雙快試驗(yàn)”對(duì)Hp感染診斷有極重要的鑒別意義。用作細(xì)菌培養(yǎng)的平板置37℃微嗜氧環(huán)境或CO2環(huán)境中培養(yǎng)3d~4d。細(xì)菌生長(zhǎng)后,對(duì)菌落特征、生化反應(yīng)、形態(tài)學(xué)研究及多種抗生素、中藥的藥敏試驗(yàn)等項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行觀察。
1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
取5只成年健康狗,用硫苯妥鈉靜脈麻醉后進(jìn)行纖維內(nèi)鏡觀察,并從胃竇小彎距離門2cm取活檢兩塊、胃體小彎活檢兩塊、分別進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查及病理組織學(xué)檢查;顧z之后,由活檢孔道插塑料導(dǎo)管,向胃注入事先制作的新鮮純Hp活菌液5ml(含菌數(shù)約為108/ml)結(jié)束檢查之后動(dòng)物隔離飼養(yǎng),于第二周再灌5ml,第3,4,5,6,7,8周各作內(nèi)鏡檢查一次并活檢,標(biāo)本處理同前。取健康大白鼠10只,其中兩只處死后取其全胃,于胃竇體各剪兩塊標(biāo)本分別進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查及病理組織學(xué)檢查。其它大白鼠均用胃管向胃內(nèi)注入純Hp菌液1ml(含菌數(shù)同上)、第2周再灌1ml,于第3,4,5,7周各處死兩只,取出胃標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)及病理組織學(xué)檢查,方法同前。取健康小白鼠10只,用與大白鼠同樣的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 臨床研究
1000例各胃十二指腸疾病中微生物學(xué)不同方法的Hp檢出率見(jiàn)表1。以十二指腸球部潰瘍、十二指腸球炎及胃潰瘍的檢出率最高。快速診斷陽(yáng)性而培養(yǎng)陰性者18例,快速診斷陰性而培養(yǎng)陽(yáng)性者25例。一例尿素酶試驗(yàn)陽(yáng)性而氧化酶鑒測(cè)為陰性,經(jīng)細(xì)菌學(xué)鑒定為大量變形菌污染。126例病理組織學(xué)切片用不同染色方法的Hp檢出率見(jiàn)表2,其中細(xì)菌學(xué)陽(yáng)性、切片陰性者12例,細(xì)菌學(xué)陰性切片陽(yáng)性者3例。有16例胃潰瘍患者的胃標(biāo)本同時(shí)取自胃竇距幽門2cm以內(nèi)胃粘膜及胃潰瘍組織,取自胃竇粘膜的標(biāo)本中有10例Hp微生物學(xué)檢查為陰性,取自潰瘍組織的標(biāo)本及2例陽(yáng)性。10例胃癌患者胃竇粘膜標(biāo)本中有6例Hp陽(yáng)性,取自癌組織的標(biāo)本無(wú)一例陽(yáng)性,這表明Hp不易在潰瘍及癌組織中存在。
表1 胃十二指腸疾患1000例Hp微生物學(xué)檢出率
內(nèi)鏡診斷 | 尿素酶(%) | 氧化酶(%) | 培養(yǎng)(%) |
淺表性胃炎 | 244/518(47.1) | 243/518(46.9) | 127/305(41.6) |
萎縮性胃炎 | 72/174(41.4) | 72/174(41.4) | 72/158(45.6) |
胃潰瘍 | 41/56(73.2) | 41/56(73.2) | 38/55(69.1) |
胃 癌 | 24/47(51.0) | 24/47(51.0) | 11/45(24.4) |
胃息肉 | 5/12(41.7.0) | 5/12(41.7.0) | 2/5(40.0) |
十二指腸潰瘍 | 98/121(81.0) | 98/121(81) | 99/119(83.2) |
十二腸炎 | 30/38(78.9) | 30/38(78.9) | 20/38(73.7) |
食管癌 | 2/6(33.3) | 2/6(33.3) | |
食管炎 | 14m.f1411.cn/28(50.0) | 14/28(50.0) | 14/23(60.9) |
合 計(jì) | 530/1000(53.0) | 529/100(52.9) | 391/748(52.3) |
表2 胃活檢標(biāo)本126例切片Hp陽(yáng)性結(jié)果比較
內(nèi)鏡及病理診斷 | n | W-S染色 | HE染色 |
慢性淺表性胃炎 | 47 | 22(46.8) | 20(42.5) |
慢性萎縮性胃炎 | 18 | 6(33.3) | 5(27.8) |
胃 潰 瘍 | 16 | 10(62.5) | 10(62.5) |
胃 癌 | 10 | 6(60.0) | 6(60.0) |
十二指腸球部潰瘍 | 20 | 16(80.0) | 15(75.0) |
十二指腸炎 | 15 | 11(73.3) | 10(66.7) |
Hp為革蘭陰性桿菌,菌體常呈現(xiàn)彎曲狀、或呈S形,短螺旋形及海鷗展翼形。主要位于胃粘膜的胃粘液層下,常集居成團(tuán),電鏡下觀察菌體表面帶有光滑外衣,菌體一端長(zhǎng)有3~6根鞭毛,鞭毛末端有的呈球狀。Hp為兼性厭氧菌,但屬于微需氧范圍。在無(wú)氧條件下不生長(zhǎng),氧含量超過(guò)5%時(shí)則發(fā)育不良甚至不能生長(zhǎng),該菌在27℃以下及42℃以上均不能生長(zhǎng),最適宜溫度為37℃,并要求培養(yǎng)罐中保持較高濕度(相對(duì)濕度98%)。Hp在培養(yǎng)基上形成的菌落由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不同而大小各異。在哥倫比亞瓊脂上菌落較大,可達(dá)2mm左右,在其它培養(yǎng)基上均為1mm左右的小菌落,菌落為圓形,略平、光滑或稍暗淡、無(wú)色、半透明狀、無(wú)粘性、有時(shí)可見(jiàn)有狹窄的模糊不清的溶血環(huán),無(wú)特殊氣味。本菌生化反應(yīng)主要表現(xiàn)為尿素酶陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性,氧化酶陽(yáng)性、磷酸酶陽(yáng)性。不利用糖類、不分解馬尿酸、靛基質(zhì)和硝酸鹽還原試驗(yàn)均為陰性。
Hp對(duì)多種抗生素均顯示高度敏感染,其最小抑菌度為:氨芐青霉素0.5ml/L,amoxycillin0.25ml/L,紅霉素0.25ml/L,青霉素1mg/L,四環(huán)素10g/L,慶大霉素10g/L,metronidzole5g/L,rimcthoprin2.5g/L,萘啶酸30g/L,但本菌對(duì)多粘菌素B、二性霉素、吡呱酸、萬(wàn)古霉素等耐藥。對(duì)某些中藥如黃柏、黃蓮、黃芩等亦顯示敏感。
2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
5只健康成年狗實(shí)驗(yàn)前內(nèi)鏡及活檢病理組織學(xué)檢查,胃粘膜基本正常,Hp尿素酶快速診斷培養(yǎng)及切片染色均為陰性。接種Hp1周后有3只狗內(nèi)鏡及活檢胃粘膜有淺表胃炎癥改變,切片W-S染色發(fā)現(xiàn)少數(shù)Hp、尿素酶及Hp培養(yǎng)亦為陽(yáng)性反應(yīng),其中兩只持續(xù)3周,一只3周以后胃粘膜炎癥消失,Hp轉(zhuǎn)陰。另兩例灌注菌液前后內(nèi)鏡檢查胃粘膜正常,Hp試驗(yàn)陰性。
10只大白鼠及10只小白鼠前后各階段檢查胃粘膜均基本正常,Hp檢查陰性。
3 討論
本文材料顯示蘭州地區(qū)人群胃粘膜中Hp的檢出率很高,與粘膜的病理組織學(xué)炎癥和消化性潰瘍密切相關(guān),這些結(jié)果與國(guó)內(nèi)外一些報(bào)道基本一致,尿素酶試驗(yàn)培養(yǎng)及組織學(xué)切片檢查對(duì)Hp檢出率幾乎同樣敏感。一般認(rèn)為使用特殊的W-S染色是檢查Hp的較好方法,細(xì)菌是紫色,很容易辨認(rèn),但操作煩瑣費(fèi)時(shí)。我們用HE染色達(dá)到了與前者幾乎同樣的效果,部分病人用革蘭染色也能清楚顯示Hp存在。對(duì)Hp的識(shí)別主要利用其形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特片及特殊的生長(zhǎng)環(huán)境。其生化反應(yīng)主要表現(xiàn)在尿素酶及氧化酶雙相陽(yáng)性,但變形菌也可產(chǎn)生尿素酶,可呈尿素酶陽(yáng)性反應(yīng),而氧化酶陰性。我們采用“雙快試驗(yàn)”對(duì)于鑒別Hp與變形菌的污染,提供了一項(xiàng)新方法。
為了回答Hp究竟是胃部疾患的病原菌還是共生功生菌、機(jī)會(huì)菌的問(wèn)題,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外臨床工作者、病理學(xué)家和微生物學(xué)家密切配合進(jìn)行了大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究,結(jié)果表明,胃內(nèi)Hp的存在與胃粘膜炎癥程度呈正相關(guān),而相對(duì)正常胃粘膜、胃癌、萎縮性胃炎及腸化病人胃標(biāo)本中Hp檢出率很低。我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,5只成年狗實(shí)驗(yàn)前胃粘膜正常,Hp陰性。在灌注Hp菌液1周后,有3只胃粘膜發(fā)生炎癥改變,Hp檢查陽(yáng)性。其中兩只持續(xù)3周、一只持續(xù)4周以后,胃粘膜相繼恢復(fù)正常,Hp亦轉(zhuǎn)為陰性,說(shuō)明Hp對(duì)胃炎致病因素可能有關(guān)。10只大白鼠、10只小白鼠灌注菌液前后胃粘膜無(wú)明顯改變,Hp檢驗(yàn)陰性。是否Hp對(duì)嚙齒類動(dòng)物無(wú)致病性,值得進(jìn)一步研究。
病理組織學(xué)染色觀察,Hp主要位于胃竇粘膜的粘液層下,常聚集成團(tuán),在胃體食管及十二指腸粘膜中有時(shí)也發(fā)現(xiàn)少數(shù)Hp存在,但檢出率遠(yuǎn)低于胃竇粘膜。觀察結(jié)果還表明,在同一病例中胃竇粘膜Hp檢查陽(yáng)性,而潰瘍及癌組織中Hp常為陰性,說(shuō)明Hp不易在潰瘍及組織存在。