本品系用狂犬病固定毒（aG)適應(yīng)株接種原代地鼠腎單層細胞，培養(yǎng)后收獲病毒液，加入甲醛溶液滅活后濃縮，再加氫氧化鋁制成。用于預防狂犬病。
1 毒種
1.1 毒種來源
狂犬病固定毒aG適應(yīng)株系用狂犬病固定毒北京株先在地鼠腎細胞傳代適應(yīng)后，再通過豚鼠腦內(nèi)交替?zhèn)鞔m應(yīng)而成。由中國藥品生物制品檢定所檢定、保存與分發(fā)。生產(chǎn)用毒種傳代應(yīng)不超過10aG交替代。
1.2 毒種檢定
1.2.1無菌試驗
aG毒種每次傳代收剖后均須做無菌試驗，合格者方可使用。
1.2.2病毒滴定
aG毒種用體重11～13g小白鼠進行腦內(nèi)病毒滴定，滴度≥8.0LogLD50/1.0ml方可用于生產(chǎn)。
1.2.3純毒試驗
生產(chǎn)前和生產(chǎn)末期用小白鼠做腦內(nèi)法中和試驗，以鑒定毒種的特異性。所用特異性抗血清由中國藥品生物制品檢定所提供。中和指數(shù)必須在500以上。生產(chǎn)過程中如對毒種發(fā)生疑問，應(yīng)及時進行鑒定。
1.3 毒種傳代
選擇體重120～160g健康豚鼠，腦內(nèi)注射，選潛伏期80～100小時具有典型狂犬病癥狀者放血致死，無菌取腦。豚鼠腦連續(xù)傳代不超過5代。
1.4 毒種保存
供生產(chǎn)用aG株在-60℃以下保存，不得超過1年。
2 疫苗制造
2.1 細胞制備
2.1.1地鼠
選用12～14日齡健康地鼠，如腹腔有充血、滲出液、腎臟異常等應(yīng)廢棄。
2.1.2解剖
處死地鼠，用消毒液洗滌皮毛數(shù)次，末次浸泡一定時間，無菌取腎，置于瓶中剪碎。
2.1.3細胞消化及分裝
將剪碎腎塊洗滌數(shù)次，加入適量胰蛋白酶消化液，置2～8℃過夜（約16～20小時)或37℃水浴消化適當時間，棄去消化液，經(jīng)洗液洗滌2～3次，振搖或吹打分散細胞，加入適量生長液，分裝培養(yǎng)瓶，置37℃±0.5℃培養(yǎng)長成單層。
2.1.4使用液體
均不得含青霉素或其他β內(nèi)酰胺類抗生素。
2.1.4.1生長液
為含不超過10%小牛血清水解乳蛋白SMI液或其他適宜培養(yǎng)液，可加入適量抗生素。
2.1.4.2浸泡液
為水解乳蛋白SMI液或其他適宜培養(yǎng)液，其中保護劑可選用0.1%以上人白蛋白，可加入適量抗生素。
2.1.4.3維持液
為199或其他適宜的溶液，其中保護劑中可選用0.4%以上人白蛋白，可加入適量抗生素。
2.1.5外源因子www.med126.com檢查
每生產(chǎn)批細胞留5%（或不少于500ml)懸液作為對照細胞檢查外源病毒。該細胞除不接種病毒外，細胞濃度和處理均與生產(chǎn)過程平行進行。至原液收獲之日用顯微鏡觀察，應(yīng)無病變發(fā)生。并用0.2%～0.5%豚鼠紅細胞（4℃保存不超過7天)進行血吸附試驗，置4～8℃30分鐘判定結(jié)果；再置20～25℃30分鐘再次判定結(jié)果，均應(yīng)為陰性。如有可疑病變或血吸附可疑陽性，在同種細胞上繼續(xù)盲傳，如傳出病毒，該批細胞制備的疫苗應(yīng)予廢棄。
2.2 病毒接種和病毒液收獲
2.2.1病毒接種
將長成單層細胞瓶傾去營養(yǎng)液，換入浸泡液。同時將無菌試驗合格的aG株搖碎后，經(jīng)1000r/min離心10分鐘，吸取上清液按1∶1000～1∶4000種入細胞瓶，也可將細胞與病毒同時接種，置32～37℃繼續(xù)培養(yǎng)。
2.2.2洗換
種毒后吸附適當時間傾去浸泡液，用Hanks液或其他適宜液體洗滌細胞，然后換入維持液，置32～37℃繼續(xù)培育。
2.2.3病毒液收獲
洗換后觀察細胞生長情況，選擇適當天數(shù)收獲病毒液，取樣品做病毒滴定及無菌試驗。
2.2.4病毒滴定
將樣品做10倍系列稀釋，取3個稀釋度的病毒液，每個稀釋度用體重11～13g小白鼠4只，每只腦內(nèi)接種0.03ml，逐日觀察，14日判定結(jié)果，計算LD50（3日內(nèi)死亡者不計)。滴度要求在5.5LogLD50/1.0ml以上�？芍卦�1次。
2.3 滅活
病毒液內(nèi)加入1/4000～1/5000的甲醛溶液，置32～37℃或2～8℃或其他適宜溫度滅活一定時間。
2.4 過濾合并
將無菌試驗合格的病毒液用濾球或絹布過濾后合并即為原液。
2.5 防腐劑
按0.005%～0.01%加入硫柳汞。
2.6 超濾濃縮
原液按其滴度進行不同倍數(shù)濃縮。按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行無菌試驗。
3 疫苗劑型
3.1 液體濃縮疫苗
病毒液滅活經(jīng)超濾濃縮后再加入Al（OH)3，使最終含量為0.4～ 0.7mg/ml。
3.2 凍干濃縮疫苗
用適當方法進行超濾或精制，然后凍干。
3.2.1凍干保護劑
1%明膠和5%蔗糖或其他適宜保護劑。
3.2.2疫苗稀釋
將保護劑按比例加入疫苗內(nèi)，充分搖勻，取樣做凍干前無菌試驗后立即分裝與凍干。
4 半成品檢定
4.1 無菌試驗
按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。
4.2 滅活試驗
將樣品腦內(nèi)接種體重11～13g小白鼠10只，每只0.03ml，觀察14天，應(yīng)健存，非特異死亡不超過20%。小白鼠如發(fā)病死亡，可繼續(xù)滅活并進行滅活試驗。
4.3 殘余牛血清蛋白含量
用檢定所認可的試劑和方法測定，液體濃縮疫苗與凍干濃縮疫苗牛血清蛋白含量應(yīng)≤50ng/ml。
5 分裝
半成品檢定合格后即可進行分裝。液體濃縮疫苗每支裝量2ml，凍干濃縮疫苗每支裝量1ml或2ml。
6 成品檢定
6.1 效力試驗
由質(zhì)量檢定部門進行。
6.1.1攻擊毒株
攻擊毒株（CVS)由中國藥品生物制品檢定所發(fā)給。
6.1.2擊毒株的制備
6.1.2.1啟開凍干毒種：稀釋成10-2懸液，用體重11～13g小白鼠，腦內(nèi)接種0.03ml，連續(xù)傳2～3代，收腦時應(yīng)選擇4～5天有典型狂病癥狀的腦組織，放-60℃低溫保存。
6.1.2.2病毒懸液的制備：將鼠腦研磨并加入適量正常馬血清或小牛血清蒸餾水，制成20%懸液，經(jīng)1000r/min沉淀10分鐘，吸取上清液分裝安瓿或小管，儲存于-60℃冰箱中，經(jīng)用體重18～20g小白鼠做病毒滴定，符合要求后，方可作攻擊毒用。
6.1.3疫苗參考對照品。
由檢定所定期發(fā)給。
6.1.4待檢疫苗
取同批安全試驗合格疫苗用pH7.6PBS做5倍連續(xù)稀釋，一般采用3個稀釋度以上進行免疫，如1∶5、1∶25、1∶125的稀釋度。
6.1.5免疫
選用體重12～14g的小白鼠，免疫時應(yīng)同時有參考對照品的對照和攻擊病毒LD50測定的對照小白鼠，參考對照品可做1∶25、1∶125和1∶625共3個稀釋度進行免疫，每只小白鼠腹腔注射0.5ml，間隔一周再免疫一次，免疫時將疫苗保存在冰浴中，各組小白鼠都應(yīng)在同樣的條件下飼養(yǎng)。
6.1.6攻擊
小白鼠于第一次免疫后14天，用預先測定含5～100個LD50的病毒量腦內(nèi)攻擊0.03ml/只。病毒測定用10-0、10-1、10-2、10-3，每稀釋度不少于8只，疫苗免疫組小白鼠每個稀釋度為14～16只，所有小白鼠自攻擊之日起觀察14天。第5天后死亡和呈現(xiàn)典型腦病癥狀也作為因狂犬病死亡而計算在內(nèi)。
6.1.7判定結(jié)果和合格指標
要求原病毒懸液注射的小白鼠80%以上死亡，攻擊病毒含量為5～100個LD50。液體濃縮疫苗合格指標應(yīng)≥2.5IU/安瓿（2ml)，凍干濃縮疫苗應(yīng)≥2.5IU/安瓿（1ml或2ml)。疫苗不合格可復試一次。
6.2 物理檢查
液體濃縮疫苗應(yīng)為橘紅-紫紅色混濁液體，久放形成可搖散的沉淀。凍干濃縮疫苗為淡黃色疏松體。
6.3 化學測定
按《生物制品化學檢定規(guī)程》進行。
6.3.1 pH值
pH值應(yīng)為7.2～8.0。
6.3.2氫氧化鋁含量
不得超過0.7mg/ml。
6.3.3硫柳汞含量
不得超過0.01%。
6.3.4游離甲醛含量
不得超過0.015%。
6.3.5水分
凍干疫苗水分不得超過3.5%。
6.4 無菌試驗
按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。
6.5 毒性試驗
取疫苗接種11～13g小白鼠10只，m.f1411.cn每只腹腔注射0.5ml，觀察7天，應(yīng)健存。
6.6 稀釋液
凍干濃縮疫苗用滅菌注射用水或其他適宜稀釋液稀釋，其質(zhì)量應(yīng)符合《中國藥典》規(guī)定。
7 保存與效期
疫苗應(yīng)保存于2～8℃。液體濃縮疫苗由效力合格之日起效期為1年，凍干濃縮疫苗由凍干之日起，效期為2年。
