目的基因序列與載體連接后,要導(dǎo)入細(xì)胞中才能繁殖擴(kuò)增,再經(jīng)過(guò)篩選,才能獲得重組DNA分子克隆,不同的載體在不同的宿主細(xì)胞中繁殖,導(dǎo)入細(xì)胞的方法也不相同。
由于外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化,早在1943年,Avery等就發(fā)現(xiàn)有毒肺炎雙球菌的DNA與無(wú)毒肺炎雙球菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生有毒性的肺炎雙球菌后代的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。但DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率很低,在分子生物學(xué)和基因工m.f1411.cn程工作中可采取一些方法處理細(xì)胞,經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA,稱為感受態(tài)細(xì)胞,再與外源DNA接觸,就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿菌經(jīng)冰冷CaCl2的處理,就成為感受態(tài)細(xì)菌,當(dāng)加入m.f1411.cn/zhuyuan/重組質(zhì)粒并突然由4℃轉(zhuǎn)入42℃作短時(shí)間處理,質(zhì)粒DNA就能進(jìn)入細(xì)菌;用高電壓脈沖短暫作用于細(xì)菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率,這稱為電穿孔(electroporation)轉(zhuǎn)化法。
噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌,病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖就是感染(infection)。用經(jīng)人工改造的噬菌體活病毒作載體,以其DNA與目的序列重組后,在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒,就能以感染的方式進(jìn)入宿主細(xì)菌或細(xì)胞,使目的序列得以復(fù)制繁殖。感染的效率很高,但DNA包裝成噬菌體或病毒的操作較麻煩。
重組的噬菌體DNA也可象質(zhì)粒DNA的方式進(jìn)入宿主菌,即宿主菌先經(jīng)過(guò)CaCl2,電穿孔等處理成感受態(tài)細(xì)菌再接受DNA,進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌的噬菌體DNA可以同樣復(fù)制和繁殖,這種方式稱為轉(zhuǎn)染(transfection)。M13噬菌體DNA導(dǎo)入大腸桿菌就常用轉(zhuǎn)染的方法。重組DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞也常用轉(zhuǎn)染方式。最經(jīng)典的是1973年建立的磷酸鈣法,其利用的基本現(xiàn)象是:DNA如以磷酸鈣-DNA共沉淀物形式出現(xiàn)時(shí),培養(yǎng)細(xì)胞攝取DNA的效率會(huì)顯著提高。用電穿孔法處理培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞也能提高細(xì)胞攝取DNA能力,但所用外加電場(chǎng)的強(qiáng)度、電脈沖的長(zhǎng)度等條件與處理細(xì)菌者都很不相同。近年來(lái)用人工脂質(zhì)膜包裹DNA,形成的脂質(zhì)體(Liposome)可以通過(guò)與細(xì)胞膜融合而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞,方法簡(jiǎn)單而有效,現(xiàn)有商售的脂質(zhì)體試劑,使用日益廣泛。