實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第一節(jié)　抗生物素—生物素免疫細(xì)胞化學(xué)染色法

一、基本原理

很早以前，人們就注意到給動(dòng)物飼以大量的雞蛋白，會(huì)引起明顯的“維生素H缺乏癥”，也稱為“蛋白質(zhì)傷害”。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在雞蛋白中含有一種堿性蛋白，分子量為68000，屬于糖蛋白，當(dāng)時(shí)命名為卵白素（Avidin)，卵白素具有4個(gè)同維生素H（Riotin,又名生物素)親合力極高的結(jié)合點(diǎn)。給動(dòng)物飼以大量雞蛋白所致的維生素H缺乏，就是由于卵白素和大量的維生素H結(jié)合所致。維生素H（以下統(tǒng)稱生物素)是一種小分子的維生素，分子量為244，系轉(zhuǎn)氨甲�；�化過程中的輔酶，它與卵白素之間有很強(qiáng)的親合力，較之抗體對(duì)抗原的親合力要高出100萬倍，能夠彼此牢固結(jié)合而不影響彼此的生物學(xué)活性。同時(shí)，生物素與卵白素都具有與其它示蹤物質(zhì)如熒光素、鐵蛋白和過氧化酶等相結(jié)合的能力。免疫細(xì)胞化學(xué)工作者利用上述特性，建立了卵白素—生物素免疫染色系統(tǒng)。由于維生素H習(xí)慣上稱為生物素，為便于理解，現(xiàn)在譯名上統(tǒng)稱卵白素為抗生物素或親合素。所以卵白素—生物素免疫染色系統(tǒng)又稱為抗生物素—生物素免疫染色法。

二、幾中抗生物素—生物素染色法

1．抗生物素—生物素—過氧化酶復(fù)合物技術(shù)（Avidin Biotin–Peroxidase Complex technique, 簡稱ABC技術(shù))

（1)基本原理：ABC法是Hsu 等于1www.med126.com981年在HRAB法和LAB法的基礎(chǔ)上改良的，其特點(diǎn)是利用抗生物素分別連接生物素標(biāo)記的第二抗體和生物素標(biāo)記的酶。與LAB法和BRAB法不同的是第一抗體不為標(biāo)記物所標(biāo)記，生物素標(biāo)記的第二抗體與ABC復(fù)合物相連接。復(fù)合物是將過氧化酶結(jié)合在生物素上、再將生物素—過氧化酶連接物與過量的抗生物素蛋白反應(yīng)而制備的（圖6-1)，最后進(jìn)行顯色反應(yīng)定位。

圖6-1　ABC法

（2)操作步驟

①冰凍切片或石蠟切片均可。

②冰凍切片可用丙酮固定10min左右，0.01mol/l PBS (pH 7.2～7.6) 洗5min，更換3次。石蠟切片需經(jīng)脫蠟，系列酒精至水。

③第一抗體，室溫孵育15min。

④PBS洗5min，更換3次。

⑤加生物素標(biāo)記的第二抗體（1：200左右)，孵育15min。

⑥PBS洗5min，更換3次。

⑦加ABC復(fù)合物室溫作用15min 。

⑧PBS洗5min，更換3次。

⑨用DAB—H2O2液（配法見附錄)顯色。

⑩復(fù)染。

⑾封片、觀察。

ABC復(fù)合物的配制：經(jīng)試驗(yàn)，生物素與抗生物素之比為1：4時(shí)，能獲得最佳滿意效果。即抗生物素10μg/ml加2.5μg/ml生物素，應(yīng)用0.05mol/l Tris—HCl液，pH7.6，在應(yīng)用前30min配制。

（3)ABC法的評(píng)價(jià)及實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

ABC法具有：①敏感性強(qiáng)：Hsu等應(yīng)用ABC法與PAP法相比發(fā)現(xiàn)敏感性較PAP法高20～40倍能顯示PAP法所不能顯示的抗原。這是因?yàn)樯�物素與抗生物素間有較強(qiáng)的結(jié)合力，一個(gè)抗生物素分子具有可與生物素結(jié)合的4個(gè)活性部位，其中一部分可與生物素標(biāo)記的過氧化物酶相結(jié)合，另一部分可與生物素標(biāo)記的免疫球蛋白結(jié)合。生物素通過氨基與抗體或過氧化物酶分子相結(jié)合，一個(gè)過氧化物酶或免疫球蛋白分子可以結(jié)合多個(gè)生物素分子，從而增加了免疫球蛋白或過氧化物酶結(jié)合抗生物素的能力。在ABC反應(yīng)中，抗生物素作為橋連接于生物素標(biāo)記的酶和生物素標(biāo)記的抗體之間，而生物素標(biāo)記的過氧化物酶分子又可作為橋連接于抗生物素分子之間，于是形成了一個(gè)含有3個(gè)以上過氧化物酶分子（大于PAP復(fù)合物)的網(wǎng)格狀復(fù)合物，敏感性極大提高。②特異性強(qiáng)，背景染色淡：由于敏感性高，第一抗體和第二抗體都可被稀釋至盡可能的高度，減少了非特異性染色。③方法簡便，節(jié)　約時(shí)間：由于ABC法敏感，操作的抗原抗體反應(yīng)的時(shí)間可由PAP法所需的數(shù)天縮短為2h左右，各層抗體作用僅需15min。④國內(nèi)上海生物制品所等單位制備的生物素—抗生物素染色藥盒經(jīng)質(zhì)量鑒定符合標(biāo)準(zhǔn)，已提供國內(nèi)市場。⑤由于生物素與抗生物素具有和多種示蹤物結(jié)合的能力，可用于雙重或多重免疫染色。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

①內(nèi)源性生物素活性及其消除：生物素是一種輔酶，是在脫羧基酶、羧基轉(zhuǎn)換酶等催化的代謝環(huán)節(jié)　中所產(chǎn)生的羧基的中間載體，它存在于某些組織和細(xì)胞內(nèi)，在應(yīng)用ABC染色時(shí)會(huì)與抗生物素結(jié)合而產(chǎn)生非特異性染色。因此，對(duì)抗生物素結(jié)合性較高的組織如肝、腎、白細(xì)胞、脂肪組織和乳腺，在應(yīng)用ABC方法前應(yīng)預(yù)先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分別作用20min左右，以消除內(nèi)源性抗生物素結(jié)合活性，每次作用后用PBS洗5min，更換3次。Nar－itoku和Taylor（1982)報(bào)告神經(jīng)組織中的乳糖可與抗生物素結(jié)合產(chǎn)生假陽性反應(yīng)，以2—甲基-O-甘露糖預(yù)孵育切片可封閉神經(jīng)組織內(nèi)乳糖分子上的結(jié)合點(diǎn)，從而阻止與抗生物素蛋白的結(jié)合。必要時(shí)，也可用0.3%H2O2—100%甲醇孵育以消除內(nèi)源性過氧化 物酶活性。

②生物素制劑之間相互親合性差異大，因此在應(yīng)用ABC試劑時(shí)，應(yīng)注意廠家和批號(hào)，對(duì)購進(jìn)試劑應(yīng)進(jìn)行事先測試，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。

③ABC試劑保存溫度以4℃為佳，據(jù)報(bào)告保存可達(dá)兩年之久，仍能獲得滿意效果，而在—20℃生物活性在短期內(nèi)即被破壞。

2．橋抗生物素—生物素技術(shù)（Bridged Avidin –Biotin technique, 簡稱BRAB技術(shù))

該技術(shù)方法是用生物素分別標(biāo)記抗體和酶，然后以抗生物素為橋，把兩者連接起來（圖6-2)。

圖6-2B　RAB技術(shù)

檢查抗原時(shí)，先用生物素標(biāo)記的抗體www.med126.com與細(xì)胞（或組織內(nèi))的抗原反應(yīng)，洗去未結(jié)合的抗體，加入抗生物素孵育后，洗去未結(jié)合的抗生物素，再加入已標(biāo)記酶的生物素孵育，洗片，以細(xì)胞化學(xué)方法呈色反應(yīng)。

3．標(biāo)記生物素—抗生物素技術(shù)（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技術(shù))

以生物素標(biāo)記抗體作第一抗體，酶標(biāo)記抗生物素作為第二抗體（圖6-3)。操作步驟如下：

圖6-3　LAB技術(shù)

（1)切片在含有25～50μg/ml生物素標(biāo)記抗體（PBS液稀釋)中孵育1h，室溫。

（2)PBS洗2次，每次5min。

（3)用20～50μg/ml過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素液孵育90min，水洗。

（4)酶呈色反應(yīng)。

BRAB法和LAB示是Guesdon及其同事們（1979)建立的，由于這二種方法都需以生物素標(biāo)記第一抗體，應(yīng)用不如ABC法普遍。但用于免疫細(xì)胞中免疫球蛋白的顯示具有特異性。二者比較，LAB法手續(xù)較簡便，但靈敏度較低。

生物素—抗生物素染色法采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色中各種常用固定劑（見附錄)，均可獲得較滿意的結(jié)果。但有實(shí)驗(yàn)報(bào)告推薦“PLP”固定液（即過碘酸—賴氨酸—多聚甲醛固定液)，其配制法亦見附錄。PLP固定后，依次經(jīng)系列蔗糖磷酸緩沖液（10%，15%，20%各5min)，進(jìn)行冰凍切片，貼于載片上，置室溫風(fēng)干30min或37℃3～4h或過夜。染色前用PBS濕潤水化切片，可獲得滿意染色效果。