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實用免疫細胞與核酸:第二節(jié) 核酸(基因)探針目的核酸的制備技術(shù)

一、特異性目的核酸(或基因)的制備核酸分子探針的制備首先需要獲得所要的特異性核酸或其片段。可用以下方法制備m.f1411.cn:(1)直接分離基因核酸:即從基因組上直接用內(nèi)切酶切下所需基因。(2)化學合成基因核酸:即以單核苷酸為原料,以固相磷酸三酯法合成某一…

一、特異性目的核酸(或基因)的制備

核酸分子探針的制備首先需要獲得所要的特異性核酸或其片段。可用以下方法制備www.med126.com

(1)直接分離基因核酸:即從基因組上直接用內(nèi)切酶切下所需基因。

(2)化學合成基因核酸:即以單核苷酸為原料,以固相磷酸三酯法合成某一結(jié)構(gòu)完全清楚,分子量較小的寡核苷核。

(3)酶促合成核酸:在真核細胞中獲得特異的結(jié)構(gòu)基因。常用方法是以mRNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA,再以大腸桿菌DNA聚合酶I合成雙鏈的結(jié)構(gòu)基因。

(4)RNA探針。

二、目的核酸的擴增

在獲得特異的目的基因后,可用以下方法大量擴增制備:①用體外DNA重組技術(shù)與載體DNA相連,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進行無性繁殖。以氯化銫超速離心純化重組質(zhì)粒DNA,并以合適限制性內(nèi)切酶消化,經(jīng)凝膠電泳制備回收特異的目的核酸片段。②聚合酶鏈式反應(Poly-merase chain reaction, PCR)擴增技術(shù):利用這種先進技術(shù)能簡便快速制備大量特異性目的核酸片段。PCR技術(shù)的基本原理是利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特征,在體外用一對和欲擴增DNA片段的兩側(cè)序列互補的引物誘發(fā)聚合反應,即雙鏈DNA先高溫變性,然后在低溫下與引物退火,再在中等溫度進行鏈延伸反應。上述在三種不同溫度下的變性、退火和延伸為一個循環(huán)反應,重復這種循環(huán)反應可使DNA獲得指數(shù)性倍增,例如經(jīng)過35個循環(huán)反應,DNA可擴增1×108倍以上。

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