豬精液超低溫保存技術(shù)及其對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的作用
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1 研究歷史及應(yīng)用 1.1用鮮精進(jìn)行人工授精 人工授精可以說(shuō)是提高畜禽繁殖率最重要的管理工作。20世紀(jì)初，丹麥的種馬育種者Sand和Stribolt是最早將人工授精用作商業(yè)性工具以最大限度地利用優(yōu)良種馬精液的育種工作者，而俄羅斯研究人員Ivanoff是首位將人工授精技術(shù)在馬、家禽、牛和
綿羊生產(chǎn)上大規(guī)模成功應(yīng)用的人。 用新鮮精液進(jìn)行人工授精有眾多的好處，包括可以通過(guò)控制某些病原體的傳播來(lái)改善畜禽的健康、提高豬場(chǎng)的生物安全水平，并且由于可以減少公畜(禽)的飼養(yǎng)量而降低生產(chǎn)成本。然而，這項(xiàng)技術(shù)的主要益處是，通過(guò)利用來(lái)自遺傳學(xué)上的優(yōu)良種畜(禽)精液給眾多的母畜禽)進(jìn)行授精，使得遺傳改良速度得到顯著的提高。在這方面，加拿大魁北克省(Quebec)90％左右的商業(yè)性生產(chǎn)豬群是用新鮮精液進(jìn)行人工授精的；l983年至2003年間，肉豬背膘下降7 mm，出生到l00 kg上市體重的飼養(yǎng)期減少了26 d。 1.2超低溫保存冷凍精液的潛能 精液的長(zhǎng)期保存能給擁有優(yōu)秀種畜禽的生產(chǎn)者帶來(lái)額外的好處。自從
甘油可以作為精子的一種高效冷凍保護(hù)劑這一里程碑式的發(fā)現(xiàn)問(wèn)世以來(lái)，由于甘油在冷凍過(guò)程中能夠緩和稀釋媒介的溶質(zhì)濃度差，低溫保存已成為精液長(zhǎng)期保存的最實(shí)用方法，并且已經(jīng)有報(bào)道稱(chēng)成功地實(shí)現(xiàn)了牛精子的超低溫冷凍。雖然每次輸精時(shí)所需的冷凍精液劑量要多于新鮮精液，但是超低溫保存技術(shù)大大地促進(jìn)了農(nóng)業(yè)優(yōu)良基因的推廣，因?yàn)槔鋬鼍耗軌蚝芊奖愕剡M(jìn)行遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，并能夠保存到母畜發(fā)情時(shí)使用，一份備用的冷凍精液能夠使已死亡或生病的供精公畜繼續(xù)得到使用。 對(duì)養(yǎng)豬業(yè)更為重要的是，利用冷凍精液將有利于控制某些病原體的傳播，從而可保護(hù)畜群的健康。超低溫保存精液的生物安全保存，能夠?qū)⑼话l(fā)的傳染性疾病和自然災(zāi)害(如火災(zāi))所造成的不良影響減至最低程度。此外，公豬及其精液可在傳染性病原體上得到有效的篩選。當(dāng)然，已有報(bào)道稱(chēng)，可引起仔豬爆發(fā)斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬圓環(huán)病毒病2型可被排入表面健康的公豬精液內(nèi)。此病最近已在許多地方，尤其是加拿大、美國(guó)和歐洲，越來(lái)越受到格外的關(guān)注。此外，PCV一2感染在豬群中的流行性遠(yuǎn)高于PMWS，而且不一定會(huì)導(dǎo)致感染豬出現(xiàn)臨床癥狀或不出現(xiàn)由PMWS引發(fā)的病變。同樣，豬繁殖與呼吸綜合征是全球的一種重要疾病。雖然豬繁殖呼吸綜合征病毒主要傳播是通過(guò)與感染豬或污染物的直接接觸，但已有證明小母豬用來(lái)自PRRS病毒感染公豬的精液進(jìn)行人工授精(AI)后出現(xiàn)了血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。此外，公豬的病
毒血癥和血清學(xué)狀態(tài)不足證明PRRS病毒或PRRS病毒RNA已被排泄入精液中。以上述兩種疾病為例，對(duì)擁有較高健康水平的養(yǎng)豬場(chǎng)而言，最好在進(jìn)行人工授精前對(duì)特定批次的精液進(jìn)行篩選。然而，在等待結(jié)果期間要求對(duì)精液進(jìn)行低溫冷凍保存。 為確保全球的生物安全，成功的豬精液超低溫保存是國(guó)際市場(chǎng)所不可缺少的。根據(jù)陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典第3.2.2.6條“豬精液的包裝和儲(chǔ)存適用條件”規(guī)定，供出口的豬精液應(yīng)該盛放在滅菌的燒瓶中并分開(kāi)保存在液氮中至少28 d。 建立在用流式細(xì)胞分選儀分離攜帶x染色體或Y染色體的精子基礎(chǔ)上的性別預(yù)選已成為現(xiàn)實(shí)，并且通過(guò)體外受精和胚胎移植，或使用極低劑量的精液進(jìn)行子宮內(nèi)深部輸精后，已經(jīng)產(chǎn)出所需性別的仔豬。研究表明，性別預(yù)選技術(shù)在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用將會(huì)對(duì)育種方案、豬舍設(shè)計(jì)、營(yíng)銷(xiāo)策略以及繁殖效率產(chǎn)生極大的影響。性別分選精液的超低溫保存是商業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的，此項(xiàng)技術(shù)目前已經(jīng)在牛上建立起來(lái)。然而，與性別分選精液相配套的冷凍和處理規(guī)程并不太適合于豬的商業(yè)性應(yīng)用，對(duì)其它哺乳動(dòng)物而言也是如此。最后，基因庫(kù)的有效性取決于超低溫保存實(shí)用種質(zhì)的可用性。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織的規(guī)定，農(nóng)業(yè)生物多樣性必須得到保護(hù)。該組織的“生物多樣性保護(hù)條約”規(guī)定，其中包括家養(yǎng)動(dòng)物在內(nèi)的食品和農(nóng)業(yè)的遺傳資源是全球食品安全的生物基礎(chǔ)。家畜基因庫(kù)構(gòu)成了一個(gè)遺傳適應(yīng)性儲(chǔ)庫(kù)，后者在應(yīng)對(duì)環(huán)境的變化(如全球變暖、普遍存在的內(nèi)分泌干擾因子)、疾病、人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)所需的新物質(zhì)、變化的市場(chǎng)條件和社會(huì)需求(所有這些均是不可預(yù)知的)中充當(dāng)一個(gè)緩沖區(qū)的角色。不可能僅選擇“潛在”重要的特性進(jìn)行保存。事實(shí)上，保留物種的變異性非常重要，特別是商業(yè)生產(chǎn)的壓力要求生產(chǎn)者減少動(dòng)物品種的變異性以產(chǎn)出均勻的動(dòng)物供應(yīng)市場(chǎng)。商用梅山雜種豬由于引入了原產(chǎn)地中國(guó)太湖豬的高繁殖率特性而表現(xiàn)出農(nóng)業(yè)生物多樣性的潛力，具有西方豬種的胴體特性。稀有品種組織已經(jīng)啟動(dòng)了活體動(dòng)物保存的“寄養(yǎng)農(nóng)業(yè)計(jì)劃”，但對(duì)豬而言此類(lèi)努力往往不如家禽和小型反芻動(dòng)物那樣成功，因?yàn)楹茈y找到愿意寄養(yǎng)豬的農(nóng)場(chǎng)主。 盡管精液的長(zhǎng)期保存具有潛在的優(yōu)勢(shì)，但眾所周知豬精子對(duì)低溫非常敏感。甚至經(jīng)過(guò)數(shù)十年的研究之后，超低溫的精子保存技術(shù)繼人工授精在商業(yè)性養(yǎng)豬生產(chǎn)系統(tǒng)中應(yīng)用之后仍不足以產(chǎn)生可靠的繁殖力。 2 精子的功能 2.1精子獲能 剛射精的精液是不能進(jìn)行受精的，首先必須完成獲能及滲入卵母細(xì)胞前的頂體反應(yīng)。精子獲能廣義上是指精子進(jìn)行功能性修飾，使精子具有與卵子發(fā)生受精的能力。在體內(nèi)，精子獲能很大程度會(huì)受到雌性生殖道的互作影響，不過(guò)包括豬在內(nèi)的許多動(dòng)物其精子能夠在體外再次獲能。因獲能引發(fā)的功能改變包括精子完成頂體反應(yīng)所需的能力、所要求將精子從輸卵管壁上解脫出來(lái)的能力、精子滲入輸卵管內(nèi)及卵丘細(xì)胞間粘液的能力和精子穿越透明帶的能力。 精子獲能受外在因素和內(nèi)在因素的雙重影響，因此一旦受到外源性因子的啟動(dòng)，獲能過(guò)程似乎會(huì)自然而然地繼續(xù)發(fā)生。事實(shí)上，獲能后的精子極其脆弱，容易產(chǎn)生自發(fā)性的頂體反應(yīng)。 精子細(xì)胞膜中膽固醇的去除仿佛是引發(fā)精子獲能和發(fā)生頂體反應(yīng)的信號(hào)通道的最早激活子。膽固醇流出可增強(qiáng)膜的流動(dòng)性，同時(shí)也能改變離子通道的活性，使鈣離子和碳酸氫根離子的流動(dòng)從中獲益。鈣離子和碳酸氫根離子能直接激活精子內(nèi)可溶性腺苷酸環(huán)化酶，以催化形成cAMP。豬精子中的cAMP形成發(fā)生在孵育后的數(shù)分鐘內(nèi)，表明導(dǎo)致精子獲能的信號(hào)通道迅速打開(kāi)。 2.2精子蛋白的
酪氨酸磷酸化 繼發(fā)現(xiàn)小鼠精子獲能期間許多酪氨酸磷化以cAMP依賴(lài)性方式產(chǎn)生后，已在其他動(dòng)物中記錄到了精子獲能期間酪氨酸磷蛋白的產(chǎn)生。大多數(shù)酪氨酸磷蛋白出現(xiàn)在鞭毛附近，并且很可能參與了精子運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)控和超活化。 豬精子的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化在某種程度上不同于已經(jīng)報(bào)道的其它動(dòng)物精子蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化。與精子獲能同時(shí)發(fā)生的是出現(xiàn)了由多種蛋白質(zhì)組成的遷移至Mr 32 000處的酪氨酸磷蛋白復(fù)合體，即為“p32”。豬精子中與其獲能有關(guān)的酪氨酸磷蛋白位于精子的頭部而非鞭毛處，由此暗示其在精子獲能、頂體反應(yīng)或與母豬生殖道之間的相互作用上起著一定的作用。此外，雖然豬精子的獲能依賴(lài)于碳酸氫鹽、鈣離子和cAMP，但p32的出現(xiàn)主要取決于鈣的濃度。事實(shí)上，p32的出現(xiàn)與精子細(xì)胞的鈣水平和頂體丟失有關(guān)，并且很可能代表了一個(gè)可導(dǎo)致頂體反應(yīng)的信號(hào)分子。該假設(shè)已經(jīng)得到筆者最近證明p32的一個(gè)主要組件是“頂體結(jié)合蛋白”(可催化頂體蛋白酶的成熟)的結(jié)果所支持。對(duì)豬人工授精行業(yè)而言，非常有意義的是p32在豬精液冷凍期間出現(xiàn)。 2.3頂體反應(yīng) 頂體反應(yīng)是發(fā)生在獲能精子上的一種細(xì)胞外生理活動(dòng)，它因精子與卵子透明帶結(jié)合而被激發(fā)，期間精子頂體的外膜在與疊加的卵母細(xì)胞質(zhì)膜處多個(gè)點(diǎn)上發(fā)生膜融合，釋放出頂體的內(nèi)容物，隨后使卵子分子暴露在頂體的內(nèi)膜上。頂體反應(yīng)使獲能精子穿越透明帶，從而與卵母細(xì)胞受精。 雖然其他信號(hào)可能參與了精子的頂體反應(yīng)，但頂體反應(yīng)的基本要素是精子細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的提高，因?yàn)橛免}離子載體處理獲能精子通常足以誘發(fā)胞吐作用。頂體反應(yīng)的調(diào)節(jié)似乎包括壓力門(mén)通鈣通道的開(kāi)放，導(dǎo)致鈣離子暫時(shí)性內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平持續(xù)增加。最新的研究表明，鈣離子會(huì)直接與精子細(xì)胞內(nèi)的膜融合裝置結(jié)合，從而引發(fā)頂體反應(yīng)。精子的頂體反應(yīng)只有在精子獲能以后才能發(fā)生；因此，授精的前提是這種現(xiàn)象必須發(fā)生在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和部位。
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