豬傳染性胃腸炎及流行性
腹瀉比較研究
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豬傳染性胃腸炎及流行性腹瀉比較研究 要害詞：豬傳染性胃腸炎；豬流行性腹瀉；比較研究豬傳染性胃腸炎(porcinetransmissiblegastroenteritis，TGE)和豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrhoea，PED)分別是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的以豬
嘔吐、腹瀉、
脫水為特征的傳染病。TGE豬傳染性胃腸炎對(duì)新生 仔豬 具有高度致死率，雖然不同年齡的豬對(duì)這種病毒均易感，但5周齡以上豬的死亡率則很低。1945年，Doyle在美國首次報(bào)道發(fā)生了本病。我國1956年在廣東省首次報(bào)道，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重危害。豬流行性腹瀉是一 種豬 腸道傳染病，哺乳 仔豬 受害最嚴(yán)重。本病主要發(fā)生在冬季，夏季也可發(fā)生。20世紀(jì)70年代初首先發(fā)現(xiàn)于英國和比利時(shí)，我國從20世紀(jì)80年代初開始陸續(xù)有本病的流行。1973年先后在我國上海、遼寧、吉林、黑龍江、四川等地分離到TGE和PED病毒。目前，已成為重要的豬病毒性腹瀉病之一。多年來，包括我國在內(nèi)的許多國家為了預(yù)防和控制TGE和PED，曾投入了一定的人力、物力和財(cái)力，但迄今為止這兩種疾病仍在世界上許多國家存在，且PED可與TGE混合感染，二者在
流行病學(xué)、臨床癥狀、剖檢變化上非常相似，給臨床診斷帶來一定困難。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，TGE與PED的研究取得了較大進(jìn)展。本文就TGE和PED近年來的研究進(jìn)行比較綜述如下。1．病原特征豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒皆屬于套式病毒目冠狀病毒科、冠狀病毒屬(國際病毒分類委員會(huì)第7次分類報(bào)告，2000年)。朱維正等發(fā)現(xiàn)PED與TGE在血清學(xué)上的不一致，馬思奪采用聚乙二醇沉淀法結(jié)合蔗糖梯度密度離心法純化PED，以改良的SDS—PAGE分析表明，PED粒子有六種結(jié)構(gòu)蛋白，其分子量分別為P133KD、P240KD、P353KD、P462KD、P5163KD和P6190KD，除P5(纖突蛋白)與TGE在電泳條中帶排布有顯著差異外，其余5種結(jié)構(gòu)蛋白則與TGE很相似。上海農(nóng)科院畜牧所報(bào)道，用熒光抗體技術(shù)發(fā)現(xiàn)PED和TGE在小腸粘膜絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)的感染存在著動(dòng)態(tài)差異，TGE首先感染小腸絨毛基部的上皮細(xì)胞，以后再向絨毛的頂部發(fā)展，而PED在早期首先感染絨毛上部，以后逐步向絨毛基部發(fā)展。2．流行病學(xué)2．1TGE流行病學(xué)2．1．1流行特點(diǎn):呈季節(jié)性發(fā)生，12月至次年4月發(fā)病最多，夏季發(fā)病少。在新疫區(qū)主要呈暴發(fā)性流行，在老疫區(qū)則呈地方性流行。2．1．2臨床癥狀:潛伏期很短，約15～18h，有的可延長至2～3d，傳播快，幾天內(nèi)可波及全群。典型癥狀是出現(xiàn)短暫的嘔吐，伴有或繼發(fā)水樣腹瀉，糞便黃色、綠色或白色，因脫水體重迅速下降。病理剖檢：病變主要在胃和腸道，以小腸病變?yōu)橹�，表現(xiàn)為腸壁變薄透明，腸內(nèi)容物稀薄如水，呈黃色，偶然可見胃底出血。２．．2PED流行病學(xué)2．1．1流行特點(diǎn):本病在12月至次年3～4月間多發(fā)，夏季也有豬感染發(fā)病，但相對(duì)較少。哺乳 仔豬 、斷奶 仔豬 和育肥豬感染發(fā)病率可高達(dá)100，成年母豬發(fā)病率較低，為15～19。哺乳 仔豬 受害最嚴(yán)重，病死率平均50。本病通常在有一頭豬發(fā)病后，同圈或毗鄰豬相繼于一周內(nèi)發(fā)病，經(jīng)過2～3周后流行終止.2．1．2臨床癥狀:潛伏期，新生 仔豬 為24～36h，育肥豬為2d以上。病豬表現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水，開始時(shí)糞便黏稠，后變成水樣便;精神沉郁，厭食，消瘦并衰竭。1周齡以內(nèi)的哺乳 仔豬 常于腹瀉后2～4d內(nèi)死亡。斷奶豬、育肥豬癥狀輕，發(fā)病4～7d后逐漸恢復(fù)正常。病理剖檢：剖檢可見腸壁變薄，腸內(nèi)有黃色粘稠液體，小腸粘膜絨毛大部分萎縮變短，上皮細(xì)胞壞死脫落。全身淋巴結(jié)腫大、出血，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死。3．診斷目前，對(duì)這兩種傳染病的診斷方法主要有病毒中和試驗(yàn)，免疫熒光法，免疫電鏡法，ELISA法RT-PCR法。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，ELISA法和RT-PCR法以其敏感性高、特異性強(qiáng)越來越受到人們的重視。3．1TGE診斷方法3．1．1病毒的分離與鑒定原代和次代
豬腎細(xì)胞、豬腎傳代細(xì)胞系、豬唾液腺原代細(xì)胞、豬甲狀腺原代細(xì)胞以及McClurkinST傳代細(xì)胞已成功地用來從被感染豬的糞便及腸道內(nèi)容物中分離TGEV。在ST或豬甲狀腺細(xì)胞上的典型CPE由具有膨脹的、圓形或長形外觀如氣球的細(xì)胞組成。ST傳代細(xì)胞已用于蝕斑或IF實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)TGEV野毒株，Kemeny(1978)。為提高病毒的分離率，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加
胰酶制劑或胰蛋白酶和使用較老的細(xì)胞可進(jìn)一步提高ST細(xì)胞的敏感性，Bohl(1979)。Pocock和Garwes(1975)報(bào)道，在次代豬甲狀腺細(xì)胞用弱酸性營養(yǎng)液時(shí)TGEV增殖滴度最高。3．1．2電鏡法檢測(cè)通過電鏡負(fù)染色法證實(shí)，在感染
豬腸內(nèi)容物和糞便中有TGEV。發(fā)病期間病毒存在于病豬的許多器官中，實(shí)驗(yàn)證實(shí)除脾臟外，其他器官均可檢測(cè)到病毒，但是以空腸、十二指腸和腸系膜淋巴結(jié)中含毒量最高。通過電鏡觀察，病毒多分布在胞漿的空泡里和微絨毛間隙。在微絨毛間的病毒往往呈串球狀排列。研究證實(shí)，免疫電鏡(IEM)比常規(guī)EM技術(shù)更好，前者對(duì)檢測(cè)臨床樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物中的TGEV更敏感，并可提供病毒血清學(xué)鑒定。此外，用IEM更易區(qū)分TGEV和常見的膜類碎片，而且同時(shí)可檢測(cè)其它腸道病毒的存在。經(jīng)IEM觀察，TGEV與PEDV之間未見到免疫交叉反應(yīng)。3．1．3免疫熒光法檢測(cè)免疫熒光法(IF)和免疫過氧化物酶技術(shù)都可應(yīng)用，但前者較常用。若IF或免疫過氧化物酶試驗(yàn)呈陽性，并伴有腹瀉癥狀，則幾乎肯定為TGEV。國外在小腸上皮細(xì)胞中檢測(cè)TGE病毒抗原，采集病死豬小腸或腹瀉早期將豬捕殺，取空腸和回腸粘膜涂片或?qū)⒖漳c和回腸制備冷凍切片進(jìn)行直接或間接免疫熒光檢測(cè)的方法已經(jīng)建立，并得到廣泛應(yīng)用。但本方法必須在死后或撲殺后才能進(jìn)行。我國哈爾濱獸醫(yī)研究所研制成功了扁
桃體采樣器，采取豬只的扁桃體組織，做成冷凍切片，進(jìn)行直接免疫熒光法檢測(cè)TGE病毒抗原。本法是活體診斷，可以迅速做出判定，已廣泛應(yīng)用于疫病普查和口岸檢疫。另外，一種用抗TGEV高糖蛋白N的單克隆抗體免疫過氧化物酶技術(shù)來檢測(cè)TGEV(小腸組織)的方法已建立，且TGEV的單克隆抗體已被用IF或免疫過氧化物酶試驗(yàn)中。用上述兩種實(shí)驗(yàn)方法已在呼吸道組織和鼻腔上皮細(xì)胞中檢測(cè)出TGEV。用抗TGEV單克隆或多克隆抗體雙層夾心ELISA方法已被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)在細(xì)胞培養(yǎng)、糞便和腸內(nèi)容物中的TGEV，是一種快速且適用于從活豬中取得大量樣品的診斷方法。3．1．4血清學(xué)診斷TGEV抗體可通過數(shù)種不同的血清學(xué)方法檢測(cè)，如間接熒光抗體試驗(yàn)、間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)、放射免疫沉淀試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)(VN)等，最常用的是VN試驗(yàn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TGEV與豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)有一定相關(guān)性，血清中和試驗(yàn)(SN)特異性不強(qiáng)，可能出現(xiàn)假陽性。但在大批量檢測(cè)或?qū)θ后w進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，可先用SN試驗(yàn)進(jìn)行篩選，對(duì)陽性樣品再用如阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(B-ELISA)等特異性很強(qiáng)的試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，使TGE抗體檢測(cè)更為準(zhǔn)確、快速。張凈等用阻斷ELISA和SN法對(duì)來自美國和中國的196份
豬血清檢測(cè)TGEV抗體，結(jié)果表明上述兩種方法的檢測(cè)結(jié)果存在顯著差異。這些TGEV-SN陽性的血清(121頭份)在用阻斷ELISA檢測(cè)PRCV抗體時(shí)有57頭呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，這與Callebaut等(1989)的試驗(yàn)結(jié)果相一致，說明用SN法檢測(cè)TGEV抗體時(shí)出現(xiàn)假陽性是由于PRCV與TGEV之間能呈完全中和交叉反應(yīng)所致。周仲芳等 報(bào)道了用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的TGE病毒纖突蛋白(S蛋白)建立了一種競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)豬TGE血清抗體，獲得了較為理想的特異性和準(zhǔn)確性。之后又報(bào)道了采用同樣的重組抗原建立了一種間接ELISA用于TGE血清抗體的檢測(cè)，同時(shí)由于在結(jié)果判定中采用終點(diǎn)滴定技術(shù)，使得檢測(cè)結(jié)果的判定更直觀和迅速。3．1．5分子生物學(xué)診斷近年來，已發(fā)展了用核酸雜交探針技術(shù)如放射性探針膜雜交、放射性標(biāo)記探針原位雜交來檢測(cè)糞便樣品，感染組織或感染細(xì)胞中的TGEV基因序列。用這些探針可區(qū)別不同的腸TGEV毒株。RT-PCR和非放射性標(biāo)記物cDNA探針也已被用來區(qū)分TGEV和PRCV分離物。1997年，Woods和Paton等應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TGEV，結(jié)果證實(shí)RT-PCR是一種特異、敏感的TGEV診斷方法。李軍等 建立了檢測(cè)TGEV的RT-PCR方法。用此RT-PCR方法檢測(cè)56份豬腹瀉糞樣，同時(shí)用夾心ELISA法作對(duì)照。結(jié)果顯示，RT-PCR法檢測(cè)的20份陽性糞樣，用夾心ELISA法檢測(cè)有14份呈陽性，兩者的符合率為89。試驗(yàn)結(jié)果表明，RT-PCR法可檢出1pg的TGEVRNA，比夾心ELISA法敏感性更高。最近KimL和ChangKO針對(duì)TGEV與PRCV二者S基因部分序列的差異性發(fā)展了一種將巢式PCR與RT-PCR相結(jié)合的方法即RT-巢式PCR法。3．2PED診斷方法3．2．1免疫電鏡法IEM法既可用已知的PEDV高免血清檢測(cè)未知抗原，又可用已知的PEDV抗原檢測(cè)未知抗體。王繼科等把抗原和抗體分別經(jīng)10000g離心、免疫復(fù)合物又經(jīng)12000g離心、最后在電鏡下直接觀察到典型的病毒粒子形成的免疫復(fù)合物，建立了具有3次篩選作用的改良的IEM法，具有簡(jiǎn)便、直觀、快速和定性正確等優(yōu)點(diǎn)。3．2．2免疫熒光法用直接免疫熒光法(FAT)檢測(cè)PEDV是可靠的特異性診斷方法，目前應(yīng)用最為廣泛。崔現(xiàn)蘭等應(yīng)用FAT檢查病豬小腸的冷凍切片或小腸抹片，對(duì)PEDV人工感染 仔豬 的檢出率為91.4，電鏡觀察陽性率為47.8。應(yīng)用間接免疫熒光法(IFAT)對(duì)PED陽性豬血清的檢出陽性率為89。林志雄等用適應(yīng)于Vero、PK15等傳代細(xì)胞株生長繁殖的PEDV-G1株建立直接免疫熒光法。該方法并不和豬傳染性胃腸炎病毒、豬細(xì)小病毒、輪狀病毒和大腸桿菌等發(fā)生交叉反應(yīng)。3．2．3微量血清中和試驗(yàn)林志雄等建立了PED微量中和試驗(yàn)，采用適應(yīng)于傳代細(xì)胞生長的PEDVG1株，以PK15作指示細(xì)胞，48h判定。研究證實(shí)本方法檢驗(yàn)準(zhǔn)確、可靠，具有較高的敏感性，可用于流行病學(xué)調(diào)查。3．2．4ELISA法ELISA法最大的優(yōu)點(diǎn)是可從糞便中直接檢查PEDV抗原，目前應(yīng)用也較為廣泛。陳茹等用分離純化的PEDV抗原，建立斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)檢測(cè)豬流行性腹瀉(PED)抗體。采用此方法分別對(duì)來自加拿大、臺(tái)灣省進(jìn)口的 種豬 和海南省、廣東省 種豬 群的血清樣共834份進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)的抗體陽性率達(dá)21。用瓊擴(kuò)試驗(yàn)與Dot-ELISA比較，陰性血清樣品檢測(cè)符合率為100，而陽性血清樣品檢測(cè)符合率為31.8，說明后者更敏感，且該試驗(yàn)重復(fù)性較好。于強(qiáng)等用PEDV吉株豬胎腸單層細(xì)胞培養(yǎng)物，以凍融法制備抗原，建立了間接ELISA法檢測(cè)PED抗體的方法。KimO等建立了單克隆抗體基礎(chǔ)上的免疫組化法，該方法可在福爾馬林固定、石蠟包埋的腸組織中準(zhǔn)確而特異的檢出PEDV，可用于鑒別診斷TGEV與PEDV。3．2．5RT-PCR法Ishikawa等根據(jù)S基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)可擴(kuò)增目的片段854bp的引物，成功的建立了診斷PEDV的RT-PCR法，可進(jìn)行細(xì)胞毒和糞便毒的檢測(cè)，靈敏度可達(dá)100TCID50mL，并可在8h內(nèi)測(cè)出。Kubota等 1 根據(jù)N基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)可擴(kuò)增目的片段540bp的引物，成功地建立了診斷PEDV的RT-PCR法，可進(jìn)行細(xì)胞毒和糞便毒的檢測(cè)。在韓國KimO等已建立了TGEV和PEDV的二聯(lián)RT-PCR診斷方法，可同時(shí)檢測(cè)出10TCID50mL的TGEV和PEDV。KimO等對(duì)免疫組化、原位雜交、RT-PCR3種方法進(jìn)行了比較，認(rèn)為RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性最好。此外，KimO等]還建立了鑒別TGEV和PEDV的多重巢式RT-PCR法。國內(nèi)喬憲鳳等以PEDV的膜蛋白(M)的RNA為模板，根據(jù)Durate等人發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)3條位于PEDV膜蛋白(M)基因上的引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，確立了RT-PCR最適反應(yīng)條件。4鑒別診斷豬傳染性胃腸炎及流行性腹瀉皆屬于病毒性腹瀉病，診斷時(shí)要注重與一般條件因素引起的腹瀉，飼料因素引起的腹瀉，以腹瀉為主要癥狀的傳染病，伴有腹瀉癥狀但以其他臨床癥狀為主的疾病進(jìn)行鑒別診斷。5防治哈爾濱獸醫(yī)研究所的科研人員研制出豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉
氫氧化鋁滅活二聯(lián)苗，此苗在母豬產(chǎn)前20-30d接種4ml， 仔豬 斷奶后10-15d接種一次，免疫效果比較好。此外，劉萬鈞等在實(shí)驗(yàn)室證實(shí)了豬白細(xì)胞干擾素在Vero細(xì)胞培養(yǎng)中和乳豬空腸結(jié)扎腸段中對(duì)PEDV有明顯的干擾作用，還用干擾素對(duì)斷奶 仔豬 進(jìn)行PED防治試驗(yàn)取得了良好結(jié)果。對(duì)豬病毒性腹瀉癥無特效治療方法，但為了防止繼發(fā)感染和脫水造成衰竭，降低死亡率和促進(jìn)康復(fù)，可以采取一些對(duì)癥療法。
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