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豬病預(yù)防:針對豬圓環(huán)病毒的檢測技術(shù)研究進展

針對豬圓環(huán)病毒的檢測技術(shù)研究進展
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豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒(PCV)感染引起的,以免疫抑制為特征的一類病毒性傳染病,臨床表現(xiàn)主要是由PCV-2引起的仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征。文章就近幾年國內(nèi)外對該病毒檢測技術(shù),包括病毒分離、電鏡觀察、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、間接免疫熒光試驗、免疫組織化學(xué)技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、原位核酸雜交試驗等的研究進展做了闡述! ∝i圓環(huán)病毒病是近年來倍受關(guān)注的一種在世界各地廣泛存在的慢性疾病,是一系列疾病的總稱。自1974年Tischer I等首次發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)以來,隨著對PCV研究的深入,根據(jù)豬圓環(huán)病毒的致病性及其基因組差異又可將其分為無致病性的豬圓環(huán)病毒1型(PCV-1)和有致病性的豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)。PCV-1對豬無致病性,但能產(chǎn)生血清抗體,在豬群中普遍存在,接種2日齡與9日齡的豬無臨床癥狀。PCV-2對豬有致病性,主要導(dǎo)致一種以斷奶仔豬呼吸急促或困難、腹瀉、貧血、明顯的淋巴組織病變和進行性消瘦為特征的新的疾病,即斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS),造成了很大的經(jīng)濟損失。由于豬群中普遍存在著PCV抗體,單一的抗體陽性不能確診為陽性,確診必須依靠實驗室方法檢測出PCV-2抗原或核酸。由于病毒復(fù)制困難,所以檢測和防控研究非常困難。同時,該病易與一些病毒性和細菌性疾病混合或繼發(fā)感染,因此僅憑癥狀、病變及流行病學(xué)調(diào)查很難做出準(zhǔn)確判斷。為此,各國獸醫(yī)工作者進行了大量的研究,建立了多種高度特異性的病毒學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法。文章就目前國內(nèi)外PCV的檢測技術(shù)研究進展進行綜述。  1、病毒分離  豬圓環(huán)病毒的分離培養(yǎng)多數(shù)是從病豬中采取肺、肝、脾、淋巴結(jié)和扁體等組織,制成組織勻漿,用氯仿處理除去有囊膜的病毒,接種PK-15細胞,利用氨基葡萄糖短時間處理感染細胞,以促進病毒的增殖。呂艷麗等從北京、河北分離了3株P(guān)CV-2,并對其中的2株進行了測序,序列分析比較發(fā)現(xiàn),它們與歐美分離毒株具有很高的同源性。郎洪武等用Dulac豬腎傳代細胞分離到了2株圓環(huán)病毒。崔尚金等從我國的22個省市分離到了32株豬圓環(huán)病毒,并對其中6株進行了測序,呈送到GenBank。另外,還有很多研究人員從各地分離到多株豬圓環(huán)病毒。   2、電鏡觀察  電鏡下可以觀察到一種較小病毒,是豬圓環(huán)病毒特有的直徑約為17 nm的球型結(jié)構(gòu),以及大量不同形態(tài)的胞漿內(nèi)包涵體。  3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)做為一種快速、簡便、特異的診斷方法,目前為病毒學(xué)診斷、分子生物學(xué)實驗最常用的技術(shù),其優(yōu)點為敏感、特異、快速、準(zhǔn)確。在PCV 的檢測方面應(yīng)用廣泛,且發(fā)展了很多改良的技術(shù)! 3.1多重PCR 檢測  Huang C I等建立了一種簡單的多重PCR法,可對PCV 進行檢測和定型。該方法設(shè)計了兩套引物,是根據(jù)PCV核酸鏈上的ORF1和ORF2設(shè)計的。Calsamiglia M等建立了一種多重PCR法,可對PCV進行檢測和定型。作者根據(jù)PCV-1和加拿大PMWS豬中分離的PCV-2的ORF1和ORF2序列設(shè)計兩套引物,這兩套引物都可以對PCV進行檢測和定型。郎洪武等根據(jù)PCV種的特異性和PCV-2型的特異性,設(shè)計兩對PCR引物,進行多重PCR檢測PCV。一對引物擴增出的片段具有PCV種的特異性,擴增區(qū)域是相對保守的ORF1部分核苷酸片段,大小約為900 bp。另一對引物擴增出的片段具有PCV-2型的特異性,擴增區(qū)域呈可變性相對較大的ORF2部分的核苷酸片段,大小約為470 bp。Kim J等在2003年建立了石蠟包埋組織中同時檢測PCV-1、PCV-2和PPV多重套式PCR法,檢測了人工感染病例和自然感染病例,結(jié)果與原位雜交方法完全一致。  3.2定量競爭性PCR檢測  定量PCR是根據(jù)PCR的產(chǎn)物量來推斷其原始模板量。Liu Q等建立了競爭性PCR方法檢測血清中的PCV 的DNA。選取PCV-1和PCV-2的ORF2中變異性高的區(qū)段設(shè)計兩對型特異性引物,并引入一個外源片段的重組質(zhì)粒,以此作為競爭性模板,用上述兩對引物擴增出的PCV-1或PCV-2片段能夠與野毒株的擴增片段相區(qū)別。當(dāng)倍比稀釋的已知濃度的質(zhì)粒DNA和待測DNA共同的PCR產(chǎn)物的電泳條帶亮度相同時,便可以推算出待測DNA的濃度。崔尚金等運用此方法在試驗過程中采用內(nèi)標(biāo)競爭模板,競爭模板和目標(biāo)模板共用一個反應(yīng)體系,不僅降低了非內(nèi)標(biāo)性模板不同PCR反應(yīng)管間的差異,而且在對樣本進行質(zhì)控監(jiān)測,排除了假陰性結(jié)果。
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做好免疫
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打防疫針
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