 |
生物大分子主要指蛋白質(zhì)（包括酶)和核酸。以蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認(rèn)識生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究生物大分子，常常需要一些高度純化并具有生物學(xué)活性的目的物質(zhì)。
生物大分子的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物學(xué)等各方面的知識，但其主要原理不外乎二個(gè)方面。一是利用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析、有機(jī)溶劑抽提、層析和結(jié)晶等。二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于不同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳、超離心、超濾等。
生物大分子制備整個(gè)過程一般可分為四個(gè)階段：（１)材料的選擇和預(yù)處理；（２)細(xì)胞的破碎（有時(shí)需進(jìn)行細(xì)胞器的分離)；（３)提取、純化（包括鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、有機(jī)溶劑抽提、吸附、層析、超離心、結(jié)晶等)；（４)濃縮、干燥及保存。
一 材料的選擇和預(yù)處理
動(dòng)物、植物及微生物都是制備生物大分子的材料，選什么材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的而定。從工業(yè)生產(chǎn)角度上考慮，注意選擇含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低的原材料。微生物具有種類多、繁殖快、培養(yǎng)簡便、誘變?nèi)菀缀筒皇芗竟?jié)影響等優(yōu)點(diǎn)，因此，它已成為制備生命大分子物質(zhì)的主要材料之一。選材時(shí)，應(yīng)注意它的生長期，微生物生長的對數(shù)期酶和核酸含量較高，可獲得高的產(chǎn)量醫(yī)學(xué)全在線搜集整,理m.f1411.cn。當(dāng)選用的微生物菌種接入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液培養(yǎng)一段時(shí)間后，用離心法收集到的上清液，即可用于制備胞外酶和某些輔基等有效成分。而收集到的菌體，經(jīng)破碎細(xì)胞處理后則可從中提取其它有效成分。前者可置低溫下短時(shí)間貯存，后者可制成凍干粉，在４℃保存，數(shù)月內(nèi)不會(huì)變質(zhì)。植物材料必須經(jīng)過去殼、脫脂并注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對動(dòng)物組織，要選擇有效成分含量豐富的臟器為原料，先進(jìn)行絞碎、脫脂等處理。對于預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存，對于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。
二 細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離
(一)細(xì)胞的破碎
細(xì)胞是生物體的結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。就真核生物而言，細(xì)胞除有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核外，還有線粒體、質(zhì)體等細(xì)胞器。通常人們所需的物質(zhì)有些分泌于細(xì)胞外，用適當(dāng)?shù)娜軇┛芍苯犹崛�；有些則存在于細(xì)胞內(nèi)，提取時(shí)必須使細(xì)胞破碎使生物大分子充分釋放到溶液中。不同生物體，或同一生物體不同的組織，其細(xì)胞破碎難易不一，使用方法也不完全相同。如動(dòng)物胰臟、肝臟、腦組織一般比較柔軟，用普通勻漿器研磨即可；肌肉及心臟組織較韌，需預(yù)先絞碎再作成勻漿。植物肉質(zhì)組織可用一般研磨方法，含纖維較多的組織則必須在高速搗碎器內(nèi)破碎或加砂研磨。許多微生物均具有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、超聲波和加壓處理等方法。現(xiàn)將生物大分子制備中組織細(xì)胞破碎的方法分別介紹于下。
1、機(jī)械法
主要通過機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破碎的方法，常用的器械有：
（1)高速組織搗碎機(jī) 適宜于動(dòng)物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子、葉和芽等材料的破碎。
（2)玻璃勻漿器 由一內(nèi)壁經(jīng)過磨砂的玻璃管和一根一端為球狀（表面經(jīng)過磨砂)的桿組成。操作時(shí)，先把絞碎的組織置于管內(nèi)，再套入研桿用手工來回研磨，或把桿裝在電動(dòng)攪拌器上，用手握住玻璃管上下移動(dòng)，即可將組織細(xì)胞研碎。勻漿器的內(nèi)桿球體與管壁之間一般只有十分之幾毫米，細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)高，機(jī)械切力對生物大分子破壞較少。適用于量少的動(dòng)物臟器組織。
（3)研磨 常用研缽研磨。細(xì)菌及植物材料應(yīng)用較多，加入少量的玻璃砂效果較好。
2、物理法
（１)反復(fù)凍融法 把待破碎樣品放至－２０℃以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次大部分動(dòng)物性的細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆�？杀黄扑椤�
（２)冷熱交替法 在細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可使用此法。操作時(shí)，將材料投入沸水中，維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。
（３)超聲波處理法 此法多用于微生物材料，處理效果與樣品濃度和使用頻率有關(guān)。用大腸桿菌制備各種酶，常選用質(zhì)量濃度為50～100mg/ml的濃度，在10～100KH2頻率下處理10至15min。應(yīng)用超聲波處理時(shí)應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在，對超聲波敏感的核酸及酶慎用。
（４)加壓破碎法 加氣壓或水壓使每平方英寸達(dá)３～５千磅的壓力時(shí)，可使90%以上細(xì)胞被壓碎，此法多用于工業(yè)上微生物酶制劑的制備。
3、化學(xué)及生物化學(xué)法
（１)自溶法 將待破碎新鮮生物材料存放在一定的pH和適當(dāng)溫度下，利用組織細(xì)胞中自身的酶系將細(xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來醫(yī) 學(xué)全,在線.搜集.整理m.f1411.cn。自溶的溫度，動(dòng)物材料常選在0～４℃，微生物材料則多在室溫下進(jìn)行。自溶時(shí)，需加少量防腐劑如甲苯、氯仿等以防止外界細(xì)菌的污染。因自溶的時(shí)間較長，不易控制，所以制備具有活性的核酸或蛋白質(zhì)比較少用。
（２)溶菌酶處理 溶菌酶具有專一地破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的功能，適用于多種微生物，另外，蝸牛酶、纖維素酶也常被選為破壞細(xì)菌及植物細(xì)胞之用。
（３)表面活性劑處理法 較常用的有十二烷基硫酸鈉（SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。
無論用那一種方法破碎組織細(xì)胞時(shí)，都在一定的稀鹽溶液或緩沖溶液中進(jìn)行，一般還需加入某些保護(hù)劑，以防止生物大分子的變性及降解。
（二)細(xì)胞器的分離
各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的分布是不同的，DNA幾乎全部在細(xì)胞核內(nèi)，RNA則主要在胞漿，各種酶在細(xì)胞內(nèi)的分布也有特定的位置。因此應(yīng)根據(jù)某一目的物質(zhì)的位置來選取材料。
