| 公開(公告)號 | CN1116416C |
| 公開(公告)日 | 2003.07.30 |
| 申請(專利)號 | CN00124700.X |
| 申請日期 | 2000.09.29 |
| 專利名稱 | 運用基因整合平臺系統(tǒng)進行藍藻轉(zhuǎn)基因及表達胸腺素a1的方法 |
| 主分類號 | C12N15/63 |
| 分類號 | C12N15/63;C12N15/31;C12N1/13;A61K38/16 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 廈門大學 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 章軍;樓士林;徐虹;羅田 |
| 地址 | 361005福建省廈門市思明南路422號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 廈門南強之路專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 陳永秀;馬應(yīng)森 |
| 國省代碼 | 福建;35 |
| 主權(quán)項 | 運用基因整合平臺系統(tǒng)進行藍藻轉(zhuǎn)基因及表達胸腺素α1的方法，其特征在于按設(shè)計從藍藻Calothrix 7601染色體DNA上PCR擴增出藻藍蛋白cpc2啟動區(qū)、整合平臺同源片段L和R，組裝了含cpc2啟動子、UBTα1目的基因、rbcS終止子、Kmr報告基因和基因平臺同源序列元件的供體質(zhì)粒pUTK，建立了Calothrix 7601新的基因整合平臺系統(tǒng)，獲得了轉(zhuǎn)UBTα1基因的藻株，其具體方法步驟如下：(1)cpc2啟動區(qū)P以及同源DNA片段L和R的克隆同源片段L和R分別選擇在cpc2操縱子的cpcB2、A2基因當中。根據(jù)絲狀藍藻Calothrix7601的cpc2操縱子的啟動區(qū)P以及同源片段L和R這三個片段兩端的核苷酸序列分別設(shè)計三對PCR引物P1和P2，L1和L2，R1和R2，其序列如下：P1(5’端引物)：5’-GCGTCGACGAATTGTAAGAA-3’SalIP2(3’端引物)：5’-ATGCATGCTCCAGCATCTCCTA-3’SphIL1(5’端引物)：5’-CGGAATTCTGCTATTAGTCCGC-3’EcoRIL2(3’端引物)：5’-CGGTCGACGCCCTCGGTTAAAGGTGT-3’SalIR1(5’端)：5’-CGGTCGACTGTAGCTCCTTAATGTC-3’SalIR2(3’端)：5’-CCTAAGCTTTCTTGATATTCGGCTG-3’HindIII其中啟動區(qū)左端引物P2設(shè)計了一個SphI酶切位點，其序列為GCATG↓C，以Calothrix7601的染色體DNA為模板，按常規(guī)的PCR技術(shù)分別擴增出0.6kb片段P，1.2kb片段L和1.2kb片段R；根據(jù)引物中的酶切位點，用SphI和SalI同時雙酶切片段P和載體pUC19，然后用T4 DNA連接酶連接，連接物轉(zhuǎn)化受體菌E.coli JM101，用藍白篩選得到白色克隆子，得重組質(zhì)粒pUCP；用HindIII和SalI同時雙酶切片段R和載體pUC19，然后用T4 DNA連接酶連接，連接物轉(zhuǎn)化受體菌E.coli JM101，用藍白篩選得到白色克隆子，得重組質(zhì)粒pUCR；用EcoRI和SalI雙酶切片段L和重組質(zhì)粒pUCP后，用T4 DNA連接酶連接，連接物轉(zhuǎn)化受體菌E.coli JM101，用藍白篩選得到白色克隆子，得重組質(zhì)粒pULP；(2)外源供體片段DNA的克�。篴.卡那霉素-Kmr報告基因和rbcS polyA終止區(qū)的克隆：選擇含有報告基因卡那霉素-Kmr和終止區(qū)rbcS polyA兩個片段的質(zhì)粒pKYLX71，用XbaI和SalI雙酶切pKYLX71，膠回收4.8Kb的DNA片段，與經(jīng)同樣雙酶切的重組質(zhì)粒pUCR連接，連接物轉(zhuǎn)化E.coli JM101，以含有Ap和Km的雙抗培養(yǎng)基篩選，獲得了8.7kb的重組質(zhì)粒pUKR；b.目的基因UBTα1的獲得及克�。喊碩α1基因的序列設(shè)計了以下PCR引物T1、T2和T2’：T1(5’端片段)：5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTGTTSphI BamHIGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’(65Nts)T2(3’端片段)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCAACSpeIAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3 (65Nts)T2’(3’端引物)：為T2之5’端的前25個核苷酸以T1和T2為引物，按常規(guī)PCR擴增得Tα1片段，以質(zhì)粒pUCUB為模板，引物為U1和U2，PCR擴增出UB片段，用BamHI酶切Tα1和UB片段后連接，再以此連接物為模板，以U1和T2’為引物擴增獲得UBTα1片段。用XbaI和HindIII不完全酶切pUKR，回收6.0Kb片段，用SphI和SpeI雙酶切目的基因UBTα1；用SphI和HindIII雙酶切pULP；將以上三種酶切片段混合后連接，轉(zhuǎn)化，以Ap和Km雙抗篩選，獲得了供體質(zhì)粒pUTK；(3)供體質(zhì)粒pUTK電激轉(zhuǎn)化Calothrix 7601用EcoRI完全酶切pUTK，獲得線狀質(zhì)粒pUTK，在電壓0.4～2.0kv，電阻100～200Ω，時間2.5～5.0ms、電容25μF的條件下電激轉(zhuǎn)化藍藻Calothrix 7601，將經(jīng)電激處理后的轉(zhuǎn)化藻株經(jīng)培養(yǎng)，以Km篩選，獲得轉(zhuǎn)UBTα1基因的藻株。 |
| 摘要 | 涉及一種基因工程，從藍藻Calothrix 7601染色體DNA上PCR擴增出cpc2啟動區(qū)、整合平臺同源片段L和R，組裝了含cpc2啟動區(qū)、UBTα1目的基因、rbcS終止子、Kmr報告基因和基因整合平臺同源序列等元件的供體質(zhì)粒pUTK，建立了Calothrix 7601新的基因整合平臺系統(tǒng)，獲得轉(zhuǎn)UBTα1基因的藻株，并從中檢測到Tα1基因的表達產(chǎn)物。本發(fā)明以藍藻作為新型基因工程受體和生物反應(yīng)器，使人的Tα1基因在其中高效表達，以大量生產(chǎn)Tα1，具有很大的開發(fā)前景。 |
| 國際公布 |
