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人血清白蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)與純化

公開(kāi)(公告)號(hào) CN1119352C  
公開(kāi)(公告)日 2003.08.27  
申請(qǐng)(專利)號(hào) CN98110844.X  
申請(qǐng)日期 1998.05.15  
專利名稱 人血清白蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)與純化  
主分類號(hào) C07K14/765  
分類號(hào) C07K14/765;C12N1/19;//C12N1/19,C12R1:84  
分案原申請(qǐng)?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(qǐng)(專利權(quán))人 中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所;上海第一生化藥業(yè)公司  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 袁中一;邱榮德;吳祥甫;李士云;夏其昌;儲(chǔ)瑞藹  
地址 200031上海市岳陽(yáng)路320號(hào)  
頒證日  
國(guó)際申請(qǐng)  
進(jìn)入國(guó)家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 上海新天專利代理有限公司  
代理人 王巍  
國(guó)省代碼 上海;31  
主權(quán)項(xiàng) 一種高表達(dá)人血清白蛋白的巴斯德畢赤酵母重組細(xì)胞的構(gòu)建表達(dá)和純化方法,其特征在于該方法包括下列步驟:一、人血清白蛋白cDNA的獲得:(1)人胚肝細(xì)胞總RNA的抽提從中國(guó)人胚肝細(xì)胞中抽提總RNA;(2)pre-HSA cDNA合成和PCR體外擴(kuò)增根據(jù)已知天然HSA基因5’和3’端序列,設(shè)計(jì)引物:引物1:5’CGGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGC3’引物2:5’CGGGATCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC3’以抽取的人肝白細(xì)胞總RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成人血清白蛋白pre-HSA cDNA;(3)所構(gòu)建基因5’端含一BamHI位點(diǎn)與ATG之間含一Kozak序列5’-CCACC-3’,3’端緊接終止密碼子含一EcoRIa位點(diǎn);二、HSA在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的表達(dá)(1)重組表達(dá)質(zhì)粒pPKQ-HSA的構(gòu)建:將PUC19-HSA克隆載體中pre-HSA基因片段用BamHI和EcoRI雙酶切下,1%瓊脂糖電泳分離,并用酚/氯仿回收。將約2Kb的pre-HSA基因回收片段,與用相同酶切的pPIC3.5K表達(dá)載體連接,轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞,涂布青霉素板篩選陽(yáng)性克隆,采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA,所得質(zhì)粒DNA用BamHI和EcoRI雙酶切鑒定出重組質(zhì)粒pPKQ-HAS;(2)表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-HSA和pPIC9k-HSA的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物3:5’CGCTCGAAAAGGGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAA3’用引物3和引物1從PUC19-HSA上PCR擴(kuò)增HSA cDNA片段,酚/氯仿抽提PCR產(chǎn)物后,用XhoI和EcoRI酶切回收,再與用相同酶切的pPIC9質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞,涂布氨芐青霉素板篩選陽(yáng)性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA,所得質(zhì)粒DNA用XhoI和EcoRI雙酶切初步鑒定重組質(zhì)粒pPIC9-HAS;取4個(gè)經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切初步鑒定的重組克隆,制備高純度質(zhì)粒DNA,采用5’AOX1 primer和3’AOX1 primer(Invitrogen),測(cè)定重組質(zhì)粒HSA cDNA兩端序列,結(jié)果有三個(gè)含完全正確的閱讀框,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的pPIC9-HSA質(zhì)粒用BamHI和EcoRI酶切并回收含HSA基因片段,與用相同酶切的pPIC9k質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞,涂布氨芐青霉素板篩選陽(yáng)性克隆,采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA,所得質(zhì)粒DNA用XhoI和EcoRI雙酶切鑒定得重組質(zhì)粒pPIC9k-HAS;(3)重組質(zhì)粒pPKQ-HSA轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞GS115(his4Mut+)將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pPKQ-HSA和pPIC9k-HSA用SalI或BglII酶切線性化,同時(shí)將空載pPIC3.5k和pPIC9k質(zhì)粒相同酶切線性化,酚/氯仿抽提回收并溶解于無(wú)菌水中,電轉(zhuǎn)化GS115細(xì)胞,涂布含不同濃度G418的YPD平板,獲得不同G418抗性的陽(yáng)性克隆,經(jīng)MD平板驗(yàn)證his+表型獲得GS115/HSA重組克隆S1B119;(4)重組克隆Pichia pastoris GS115/HSA-S1B119株細(xì)胞的表達(dá)將篩選出的GS115/HSA重組細(xì)胞接種3ml YPD試管,30℃300rpm培養(yǎng)過(guò)夜,再以0.2%~0.5%接種量接種50ml BMGy,30℃,300rpm培養(yǎng)至OD600 4~7,離心收集菌體懸于15ml含甲醇的BMMY培養(yǎng)液中,置20-30℃搖床誘導(dǎo)培養(yǎng),每24hr加甲醇至0.5ml/L,定時(shí)取樣,經(jīng)4℃離心,上清加入PMSF至1mM,-20℃凍存;三、表達(dá)HSA的分離純化(1)中空纖維柱將2L低密度誘導(dǎo)發(fā)酵液除去細(xì)胞后,用截留分子量10KDa-50KDa的中空纖維柱除去低于5OKDa的雜質(zhì)并使?jié)饪s到0.2L濃縮液,HSA收率≥95%;(2)脫色濃縮發(fā)酵液經(jīng)50℃保溫后,加入3%活性炭或732等脫色樹(shù)脂處理10分鐘后離心除去,得脫色濃縮液;(3)pharose疏水柱分離濃縮發(fā)酵液或脫色濃縮液中加入固體(NH4)2SO4直至達(dá)20%終濃度,并流過(guò)20%(NH4)2SO4平衡的Phenyl-Sepharose柱,上樣后用平衡液洗滌至流出液OD280<0.01,再改用水洗脫,收集用水洗脫的HSA蛋白,收率≥95%;(4)親和層析除去雜蛋白①無(wú)HSA發(fā)酵液抗血清-Sepharose的制備:由1所得濃縮發(fā)酵液流經(jīng)抗HSA抗體-Sepharose以除去HAS,將無(wú)HSA發(fā)酵液制得的抗血清,通過(guò)醛基結(jié)合于Sepharose;②疏水層析純化得到的水洗脫峰通過(guò)“無(wú)HSA發(fā)酵液的抗血清”親和柱,收集未吸附的蛋白峰為HSA,回收率≥98%;(5)超濾脫鹽將親和層析流出蛋白峰經(jīng)截留分子量10KDa中空纖維或超濾膜組件中脫鹽,可得純度≥99%的HSA,回收率≥98%;(6)真空冷凍干燥將脫鹽后的HSA溶液真空冷凍干燥得到HSA樣品。  
摘要 本發(fā)明涉及一種人血清白蛋白在畢赤氏酵母(Pichia pastors)中的表達(dá)與純化方法。本發(fā)明的方法特征在于重組表達(dá)質(zhì)粒pPKQ-HSA的構(gòu)建和表達(dá)HSA的高效分離純化。用該方法獲得的樣品純度高于99%。  
國(guó)際公布  
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