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您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線 >> 藥學(xué)理論 >> 中國(guó)藥品專利文獻(xiàn) >> 正文:一種栝樓毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)核酸抑制蛋白的方法專利檢索:專利號(hào)/專利人/發(fā)明人
    

一種栝樓毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)核酸抑制蛋白的方法

公開(kāi)(公告)號(hào) CN1126818C  
公開(kāi)(公告)日 2003.11.05  
申請(qǐng)(專利)號(hào) CN00109602.8  
申請(qǐng)日期 2000.06.16  
專利名稱 一種栝樓毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)核酸抑制蛋白的方法  
主分類號(hào) C12P21/00  
分類號(hào) C12P21/00;C12N1/20;C12N5/04;C07K14/415  
分案原申請(qǐng)?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(qǐng)(專利權(quán))人 清華大學(xué)  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 郭志剛  
地址 100084北京市海淀區(qū)清華園  
頒證日  
國(guó)際申請(qǐng)  
進(jìn)入國(guó)家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 北京清亦華專利事務(wù)所  
代理人 羅文群  
國(guó)省代碼 北京;11  
主權(quán)項(xiàng) 一種栝樓毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)核酸抑制蛋白的方法,其特征在于,該方法包括以下各步驟:(1)在每升MS植物培養(yǎng)基上加入20g/l蔗糖和8g/l瓊脂,在125℃,0.1mPa壓力下消毒15-18分鐘,經(jīng)冷卻后作成平板培養(yǎng)基;(2)將栝樓種子用乙醇和次氯酸鈉消毒后,接種在第1步的培養(yǎng)基上,于20-25℃,用日光燈照射,亮度為1000-3000lx,每日光照12-16小時(shí)培養(yǎng)20-30天,種子萌芽長(zhǎng)成無(wú)菌植株備用;(3)在每升LB細(xì)菌培養(yǎng)基上加入10g/l瓊脂,經(jīng)125℃,0.1mPa壓力下消毒15-18分鐘,經(jīng)冷卻后作成斜面培養(yǎng)基;(4)將發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402菌接種在第3步的培養(yǎng)基上,在35-37℃,避光條件下培養(yǎng)3天,將細(xì)菌活化;(5)將第2步培養(yǎng)出的無(wú)菌植株,從每個(gè)節(jié)間留下2枚葉片剪斷,作成外殖體,并且在節(jié)位處涂上LBA9402細(xì)菌,用接種針刺傷沾菌的節(jié)位處,然后接種在第1步的培養(yǎng)基上,在20-25℃,日光燈下,強(qiáng)度為500-1000lx,培養(yǎng)10-30天,從被刺傷的節(jié)位處形成不定根;(6)在每升MS植物培養(yǎng)基上加入蔗糖20g/l和青霉素30-150mg/l制成殺菌培養(yǎng)基,將第5步形成的不定根剪下,放在殺菌培養(yǎng)基內(nèi),培養(yǎng)3-10天,更換同樣的殺菌培養(yǎng)基內(nèi)反復(fù)除菌培養(yǎng)2-5次,徹底除掉細(xì)菌后,轉(zhuǎn)接在第1步的培養(yǎng)基內(nèi)篩選生長(zhǎng)速度最快的根系;(7)在每升MS植物培養(yǎng)基中加入20g/l蔗糖,制成培養(yǎng)液,加入篩選出的毛狀根,在20-25℃,日光燈照射,光強(qiáng)為500-1500lx,在轉(zhuǎn)速為90-150rmp的搖床上,培養(yǎng)15-25天,獲得50-100倍重量的毛狀根;(8)在生物反應(yīng)器內(nèi),加入第7步的培養(yǎng)液,再添加維生素、氨基酸、誘導(dǎo)子,經(jīng)高溫滅菌處理后,按照培養(yǎng)液重量的2-10%接種上第8步的毛狀根,在20-25℃,弱光或黑暗條件下培養(yǎng)15-30天,就會(huì)獲得50-100倍重量的毛狀根;(9)將毛狀根經(jīng)冷凍后進(jìn)行破碎處理,然后在4℃低溫下提取和分離蛋白質(zhì),經(jīng)過(guò)純化處理即獲得26kd、27kd和29kd的核酸抑制蛋白。  
摘要 本發(fā)明涉及一種栝樓毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)核酸抑制蛋白的方法,首先在植物培養(yǎng)基上加入蔗糖和瓊脂制成培養(yǎng)基,將栝樓種子接種在培養(yǎng)基上,將發(fā)根農(nóng)桿菌接種在培養(yǎng)基上,使細(xì)菌活化,將栝樓種子的無(wú)菌植株作成外殖體,接種針刺傷沾菌的節(jié)位處,從節(jié)位處形成不定根,將其接種在營(yíng)養(yǎng)液中得到毛狀根,經(jīng)純化處理即獲得核酸抑制蛋白。本發(fā)明的方法培養(yǎng)毛狀根,其產(chǎn)量可以達(dá)到200-300g/L/20日,其中核酸抑制蛋白含量達(dá)到0.5-1.0‰。  
國(guó)際公布  
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