| 公開(公告)號(hào) | CN1693461A |
| 公開(公告)日 | 2005.11.09 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200510039063.9 |
| 申請(qǐng)日期 | 2005.04.26 |
| 專利名稱 | 一種抗醛糖還原酶蛋白單克隆抗體的制備與鑒定方法 |
| 主分類號(hào) | C12N15/13 |
| 分類號(hào) | C12N15/13;C12N15/10;C12N15/70;C07K16/40;C12P21/08;C12N5/18;C12Q1/68;G01N33/53 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 東南大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 謝 維;馬 達(dá);金俊飛;張建瓊 |
| 地址 | 210096江蘇省南京市四牌樓2號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 |
| 代理人 | 葉連生 |
| 國(guó)省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種抗醛糖還原酶“AR”單克隆抗體的制備方法，其特征在于該方法為：①?gòu)恼Ｈ颂ケP組織提取總RNA；②根據(jù)已知AR序列，并使用“clustalx、antheprot”軟件得到AR的抗原性分區(qū)、以及AR與醛糖還原酶相似蛋白“ARL-1”的序列比對(duì)同源性分區(qū)，針對(duì)AR全長(zhǎng)、以及分別命名為dAR、dA1、dA2、dA3、dA4的五段截短部分設(shè)計(jì)六對(duì)引物，上游引物均含EcoRI酶切位點(diǎn)gcgaattc，下游引物均含NotI酶切位點(diǎn)gcggccgc；③通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)“RT-PCR”獲得AR全長(zhǎng)及dAR、dA1、dA2、dA3、dA4五段截短基因；④采用基因重組手段，將以上獲得的AR全長(zhǎng)及dAR、dA1、dA2、dA3、dA4五段截短基因，共六段基因分別插入表達(dá)載體pGEX-4T-1(His)6C，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliRosetta，誘導(dǎo)表達(dá)AR全長(zhǎng)及截短蛋白，獲得GST-AR蛋白及GST-dAR、GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4截短蛋白；⑤采用雜交瘤技術(shù)制備抗AR單克隆抗體：將純化的全長(zhǎng)醛糖還原酶蛋白—谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶“GST-AR”重組蛋白免疫“Balb/c”小鼠，制備脾細(xì)胞懸液，在聚乙二醇“PEG”作用下與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，將融合細(xì)胞培養(yǎng)于含次黃嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶“HAT”的培養(yǎng)基；利用純化的GST-AR蛋白包被酶標(biāo)板，同時(shí)GST包被酶標(biāo)板作為對(duì)照，根據(jù)方陣滴定結(jié)果，AR按1∶5000包被，GST按1∶3000包被，包被量均為100ng/孔；將待測(cè)的每一個(gè)雜交瘤集落孔的培養(yǎng)上清同時(shí)等量加入包被GST-AR和包被GST的酶標(biāo)板孔，同時(shí)在GST-AR和GST包被系統(tǒng)分別設(shè)三孔為對(duì)照，一孔加新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，另一孔在新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入1ul免疫小鼠的血清作為陽(yáng)性對(duì)照(P)，還有一孔在新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入1ul正常小鼠的血清作為陰性對(duì)照(N)，采用間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)“ELISA”法進(jìn)行檢測(cè)，TMB底物顯色，測(cè)定OD450值；P/N≥2.1，表示包被系統(tǒng)有效，GST-AR陽(yáng)性(P1)，同時(shí)GST陰性(N1)，P1/N1≥2.1者為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)應(yīng)的原細(xì)胞培養(yǎng)孔用有限稀釋法亞克隆2～3次，至100％培養(yǎng)孔陽(yáng)性，擴(kuò)大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定分泌抗AR蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，獲得三株能穩(wěn)定分泌抗AR單克隆抗體的細(xì)胞株，分別命名為ARB3、AR7B3G4、ARF10；將細(xì)胞培養(yǎng)在含20％新生牛血清“FCS”的RPMI1640培養(yǎng)液中，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，純化上清得到三株抗醛糖還原酶單克隆抗體。 |
| 摘要 | 抗醛糖還原酶蛋白“AR”單克隆抗體的制備與鑒定方法產(chǎn)生的抗AR單克隆抗體分別高度特異抗AR抗原的不同區(qū)段；產(chǎn)生的抗AR單克隆抗體可以作為一種新的肝癌早期診斷輔助試劑：聯(lián)合應(yīng)用抗AR單克隆抗體和抗醛糖還原酶相似蛋白“ARL-1”單克隆抗體，可能找到一個(gè)新的、特異性高的肝癌早期診斷指標(biāo)，將有助于肝癌的早期診斷，從而提高肝癌的生存率，改善其預(yù)后。經(jīng)鑒定，由純化ARB3、AR7B3G4、ARF10細(xì)胞株的培養(yǎng)上清而得到的三株抗AR單克隆抗體，Ig亞類均為IgG1，輕鏈屬于κ型；均抗GST-AR，并與胎盤組織中的AR蛋白反應(yīng)，且分別識(shí)別AR第1～79氨基酸、第111～142氨基酸、第143～316氨基酸位置，而與GST-ARL、GST、表達(dá)菌液蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。 |
| 國(guó)際公布 |
