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公開(公告)號
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CN1706947A
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公開(公告)日
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2005.12.14
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申請(專利)號
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CN200410055552.9
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申請日期
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2004.08.04
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專利名稱
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重組人甲狀旁腺激素在大腸桿菌中的構(gòu)建、表達與純化方法
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主分類號
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C12N15/16
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分類號
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C12N15/16;C12N15/70;C07K14/635;A61K38/29
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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2004.6.4 CN 200410044917.8
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申請(專利權(quán))人
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南京大學生物制藥工程研究中心
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發(fā)明(設(shè)計)人
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劉建寧;孫自勇;張 菁;陳均勇;陳新園
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地址
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210093江蘇省南京市漢口路22號南京大學蒙民偉樓22層
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構(gòu)
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南京天華專利代理有限責任公司
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代理人
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夏 平
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國省代碼
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江蘇;32
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主權(quán)項
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一種重組人甲狀旁腺激素在大腸桿菌中的構(gòu)建、表達與純化方法，其特征在于：a.重組人甲狀旁腺激素的構(gòu)建：以下述基因序列為模板，CCGCGGGTATTGAGGGTCGCTCCGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGACGTACACAACTTCTAACTCGAG，實線處分別為SacII、XhoI的酶切位點，虛線處序列編碼FactorXa識別位點Ile-Glu-Gly-Arg↓，以GGACTGCCGCGGGTATTGAGGGTCGCTCCGTTTC為上游引物序列，實線處為SacII的酶切位點，通過聚合酶鏈式反應(yīng)合成重組人甲狀旁腺激素基因；b.通過聚合酶鏈式反應(yīng)合成的重組人甲狀旁腺激素基因經(jīng)SacII、XhoI雙酶切后與經(jīng)SacII、XhoI雙酶切的表達質(zhì)粒pET-35b(+)連接，將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α宿主菌進行重組人甲狀旁腺激素的表達；c.表達的重組人甲狀旁腺激素以纖維素樹脂(CBIND200Resin)親和層析分離純化。
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摘要
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本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是包括涉及編碼人甲狀旁腺激素小肽的cDNA，和利用其表達載體制備人甲狀旁腺激素的方法。本發(fā)明將化學合成的重組人甲狀旁腺激素(1-34)基因用PCR擴增后，克隆至表達載體pET-35b(+)，使重組人甲狀旁腺激素(1-34)融合于纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBDclos)的羧基端，并得到高效表達。融合蛋白經(jīng)纖維素樹脂親和層析純化后，經(jīng)Factor Xa裂解釋放出rhPTH(1-34)，再通過纖維素樹脂親和層析、C4反向高效液相色譜純化得到rhPTH(1-34)純品。每升培養(yǎng)液可獲取3mg高純度的rhPTH(1-34)。經(jīng)質(zhì)譜測定，所得樣品的分子量為4117.0道爾頓，與rhPTH(1-34)理論分子量一致。本發(fā)明極大程度上豐富了該多肽在醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域的研究和開發(fā)。
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國際公布
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