| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1712536A |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2005.12.28 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200510057045.3 |
| 申請(qǐng)日期 | 2005.04.28 |
| 專利名稱 | 酵母細(xì)胞表達(dá)人白細(xì)胞介素24的方法 |
| 主分類號(hào) | C12N15/81 |
| 分類號(hào) | C12N15/81;C12N15/24;C12N15/66;C12P21/02 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 鄒全明;楊 珺 |
| 地址 | 400038重慶市沙坪壩區(qū)高灘巖正街30號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 重慶華科專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 康海燕 |
| 國(guó)省代碼 | 重慶;85 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種酵母細(xì)胞表達(dá)人白細(xì)胞介素24的方法，其特征在于：它選用His-的畢赤酵母GS115株、KM71株或SMD1168株作為宿主細(xì)胞，整合性表達(dá)質(zhì)粒是pPIC3.5K、pPIC9K或pAO815；該方法包括：(1)克隆人IL-24基因：以ConA刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞的總mRNA為模板，先RT-PCR擴(kuò)增出總cDNA，再用IL-24特異引物擴(kuò)增出帶有原始信號(hào)肽的IL-24或突變IL-24，即命名為mIL-24或smIL-24，或擴(kuò)增出不帶有原始信號(hào)肽的IL-24或突變IL-24，即命名為IL-24或sIL-24；IL-24和mIL-24的cDNA序列與GENBANK公布的序列完全一致，smIL-24和sIL-24的cDNA序列與Genbank公布的序列對(duì)比在同一位置發(fā)生堿基的點(diǎn)突變，并由此引起一個(gè)氨基酸的變化，核酸和氨基酸的序列表1；(2)體外構(gòu)建重組表達(dá)載體，可以是分泌性表達(dá)載體，也可以是可溶性表達(dá)載體：1)體外構(gòu)建重組分泌性表達(dá)載體：a)將不帶原始信號(hào)序列的IL-24或sIL-24分別重組到整合型表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點(diǎn)EcoR1和Not1之間，得到帶有α因子的分泌型表達(dá)載體IL-24/pPIC9K或sIL-24/pPIC9K；或者，將不帶原始信號(hào)序列的IL-24和sIL-24分別與α-因子連接而成的融合基因重組到載體pAO815的EcoRI位點(diǎn)，利用BglII和BamHI內(nèi)切酶在pAO815上體外構(gòu)建多拷貝表達(dá)盒，獲得帶有α因子的分泌型多拷貝表達(dá)載體n(αIL-24)/pAO815和n(αsIL-24)/pAO815；b)將帶有原始信號(hào)序列的mIL-24或smIL-24分別重組到整合型表達(dá)載體pPIC3.5K的多克隆位點(diǎn)BamH1和Not1之間，得到帶有IL-24自身分泌信號(hào)的分泌型表達(dá)載體mIL-24/pPIC3.5K或smIL-24/pPIC3.5K；2)體外構(gòu)建重組胞內(nèi)可溶性表達(dá)載體：將不帶原始信號(hào)序列的IL-24或sIL-245’端加上起始密碼子ATG，分別重組到載體pPIC3.5K的多克隆位點(diǎn)EcoR1和Not1之間，得到可溶性表達(dá)載體IL-24/pPIC3.5K和sIL-24/pPIC3.5K；(3)畢赤酵母轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SalI或SacI酶切成線性質(zhì)粒，通過(guò)電穿孔或原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化畢赤酵母；可溶性表達(dá)載體轉(zhuǎn)化SMD1168酵母菌株，獲得重組酵母菌株IL-24/pPIC3.5K/SMD1168或sIL-24/pPIC3.5K/SMD1168；分泌型表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化酵母菌株GS115或KM71，獲得重組酵母菌株IL-24/pPIC9K/GS115、sIL-24/pPIC9K/GS115、mIL-24/pPIC3.5K/GS115、smIL-24/pPIC3.5K/GS115、8(αIL-24)/pAO815/GS115、8(αsmIL-24)/pAO815/GS115、IL-24/pPIC9K/KM71、sIL-24/pPIC9K/KM71、mIL-24/pPIC3.5K/KM71或smIL-24/pPIC3.5K/KM71；(4)畢赤酵母表達(dá)人IL-24。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開(kāi)一種酵母細(xì)胞表達(dá)人白細(xì)胞介素24的方法，該方法先是通過(guò)克隆一種IL-24基因或具有一個(gè)堿基突變的IL-24基因；然后將它們構(gòu)建到三種表達(dá)載體pPIC3.5K、pPIC9K或pA0815上，構(gòu)建獲得8種表達(dá)載體；再選用His-的畢赤酵母GS115株、KM71株或SMD1168株作為宿主細(xì)胞，用酵母細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)可溶性表達(dá)或胞外分泌性表達(dá)，從而獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)人白細(xì)胞介素24，保證了IL-24正確的空間結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)活性。 |
| 國(guó)際公布 |
