| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1261566C |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2006.06.28 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200410005171.X |
| 申請(qǐng)日期 | 2004.02.11 |
| 專利名稱 | 非受體型酪氨酸蛋白激酶Syk的制備方法 |
| 主分類號(hào) | C12N9/12(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N9/12(2006.01)I;C12N15/54(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C07K16/06(2006.01)I;C07K16/40(2006.01)I;A61K38/45(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;G01N33/53(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 單保恩 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 馬 洪;單保恩 |
| 地址 | 050011河北省石家莊市健康路12號(hào)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心 |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 石家莊新世紀(jì)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 董金國(guó) |
| 國(guó)省代碼 | 河北;13 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 非受體型酪氨酸蛋白激酶Syk的制備方法，其特征在于它包括以下工藝步驟：A、細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)：Sf21細(xì)胞株應(yīng)用Grace′s培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞調(diào)整到1×109/L的密度，用培養(yǎng)瓶于恒溫?fù)u床在轉(zhuǎn)速為80-100轉(zhuǎn)/分、溫度26-28℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)胎盼藍(lán)染色檢測(cè)活細(xì)胞百分率應(yīng)為95％-100％；B、應(yīng)用Bac-to-Bac方法進(jìn)行制備重組Syk基因的桿狀病毒；C、純化baconidSykDNA：應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)技術(shù)，將轉(zhuǎn)染Syk基因的Sf21細(xì)胞于28℃培養(yǎng)4-6天，用Gibco-BRL公司提供的cellfectin試劑進(jìn)行選擇培養(yǎng)，收集細(xì)胞制備SykDNA；應(yīng)用噬菌體純化法純化病毒顆粒，經(jīng)培養(yǎng)一些孔形成噬菌斑，將這些陽(yáng)性培養(yǎng)孔細(xì)胞經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)Mr為72×103蛋白條帶的存在；D、Sf21細(xì)胞的大量制備：于培養(yǎng)瓶中加入1L呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf21細(xì)胞懸液，每毫升細(xì)胞懸液中的含Sf21細(xì)胞1.0-1.2×106個(gè)，加入病毒貯存液，其病毒濃度約為2.5×108pfu/mL，于恒溫?fù)u床在80-100轉(zhuǎn)/分、溫度為28℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)行病毒感染和細(xì)胞增殖，其病毒感染率約為6；E、Syk的分離、純化：收集細(xì)胞懸液進(jìn)行低速離心，將細(xì)胞數(shù)量為2.5×109的細(xì)胞沉淀物與細(xì)胞裂解液共同培養(yǎng)30分鐘，于冰浴中用超聲波破碎儀振蕩裂解3次，每次30秒，將細(xì)胞裂解液于4℃超速離心，收集上清液并過(guò)濾，將濾液加入由Sigma生產(chǎn)、規(guī)格為2.5×10cm的活化的Yellow-3層析柱，用兩倍體積的緩沖液和1倍體積的含有200mmol/LNaCl的緩沖液沖洗層析柱。Syk蛋白用3.5倍體積的含200mmol/L-1mol/LNaCl的緩沖液洗脫。 |
| 摘要 | 本發(fā)明屬于基因治療領(lǐng)域，特別是指一種輔助乳腺癌診斷、治療方案制定及估計(jì)預(yù)后的相關(guān)基因-非受體型酪氨酸蛋白激酶Syk的制備方法。主要包括細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)、應(yīng)用Bac-to-Bac方法進(jìn)行制備重組Syk基因的桿狀病毒、純化baconid Syk DNA、Sf21細(xì)胞的大量制備、Syk的分離、純化等工藝步驟。本發(fā)明解決了乳腺癌的早期診斷、治療方案選擇、病情復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后估價(jià)以及群體隨訪觀察和普查等方面的問(wèn)題，具有工藝設(shè)計(jì)合理，可輔助乳腺癌診斷、治療方案制定及估計(jì)預(yù)后等優(yōu)點(diǎn)。 |
| 國(guó)際公布 |
