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用基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)HBVDNA的方法

公開(kāi)(公告)號(hào) CN1269966C  
公開(kāi)(公告)日 2006.08.16  
申請(qǐng)(專利)號(hào) CN02807389.4  
申請(qǐng)日期 2002.03.06  
專利名稱 用基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)HBV DNA的方法  
主分類號(hào) C12Q1/68(2006.01)I  
分類號(hào) C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/70(2006.01)I  
分案原申請(qǐng)?zhí)?  
優(yōu)先權(quán) 2001.3.7 EP 01200855.3  
申請(qǐng)(專利權(quán))人 拜奧默里克斯有限公司  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 B·A·L·M·戴曼;I·M·弗蘭岑;A·M·W·斯特里杰普  
地址 荷蘭伯克斯特爾  
頒證日  
國(guó)際申請(qǐng) 2002-03-06 PCT/EP2002/002600  
進(jìn)入國(guó)家日期 2003.09.26  
專利代理機(jī)構(gòu) 中國(guó)國(guó)際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所  
代理人 唐偉杰  
國(guó)省代碼 荷蘭;NL  
主權(quán)項(xiàng) 基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增目標(biāo)HBV核酸序列的方法,該方法從存在于樣品中的HBVDNA開(kāi)始,其包括下列步驟:-在擴(kuò)增緩沖液中將疑似含有HBV的樣品與下述成分一起溫育:一或多種能夠在所選限制位點(diǎn)切割該HBVDNA的限制性內(nèi)切酶,該限制性內(nèi)切酶在該HBVDNA鏈上形成指定的3′末端;啟動(dòng)子引物或正向引物,其中具有包含DNA依賴性的RNA聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子序列的5′區(qū)域以及與該DNA鏈的指定3′末端互補(bǔ)的3′區(qū)域;第二或反向引物,其具有與啟動(dòng)子引物相反的極性且含有該目標(biāo)序列的5′末端;以及在HBVssDNA作為目標(biāo)序列的情況下,還含有限制性引物;-將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間,以進(jìn)行限制性內(nèi)切酶的消化;-將如此獲得的樣品以足以失活限制性內(nèi)切酶和/或至少部分地導(dǎo)致雙鏈發(fā)生單鏈化的溫度和時(shí)間進(jìn)行加熱處理;-向樣品中加入下列試劑,具有RNA依賴性的DNA聚合酶活性的酶具有DNA依賴性的DNA聚合酶活性的酶具有RNA酶H活性的酶具有RNA聚合酶活性的酶;和-將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間,以進(jìn)行擴(kuò)增。  
摘要 本發(fā)明提供基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增目標(biāo)HBV核酸序列的方法,該方法從可選存在于樣品中的HBV DNA開(kāi)始,其包括下列步驟:-在擴(kuò)增緩沖液中溫育懷疑含有HBV的樣品,該溫育體系中含有一種或多種能夠在選擇出的限制位點(diǎn)切割HBV DNA的限制性內(nèi)切酶,該限制性內(nèi)切酶形成指定的此HBV DNA鏈的3′末端;該溫育體系中含有啟動(dòng)子引物,該啟動(dòng)子引物具有包含被依賴DNA的RNA聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子序列的5′區(qū)域和與指定的DNA鏈的3′末端互補(bǔ)的3′區(qū)域;該溫育體系中含有第二或反向引物,其具有與啟動(dòng)子引物相反的極性且含有該目標(biāo)序列的5′末端;且在HBV ssDNA作為目標(biāo)序列的情況下,該溫育體系中含有限制性引物;-將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間,以進(jìn)行限制性內(nèi)切酶的消化;-將如此獲得的樣品以一定的溫度和時(shí)間進(jìn)行加熱處理,該溫度和時(shí)間足以失活限制性內(nèi)切酶和/或至少部分地導(dǎo)致雙鏈的單鏈化;-向樣品中加入下列試劑,具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶、具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶、具有RNA酶H活性的酶、具有RNA聚合酶活性的酶;和-將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間,以進(jìn)行擴(kuò)增。  
國(guó)際公布 2002-09-19 WO2002/072881 英  
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