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一種重組人tPA的制備方法

公開(kāi)(公告)號(hào) CN1786164A  
公開(kāi)(公告)日 2006.06.14  
申請(qǐng)(專利)號(hào) CN200510019706.3  
申請(qǐng)日期 2005.11.01  
專利名稱 一種重組人tPA的制備方法  
主分類號(hào) C12N15/09(2006.01)I  
分類號(hào) C12N15/09(2006.01)I;C12N1/21(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I;C07K1/14(2006.01)I  
分案原申請(qǐng)?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(qǐng)(專利權(quán))人 武漢大學(xué);武漢陸地生物工程有限公司  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 葉林柏;吳正輝;佘應(yīng)龍;葉 力;郜金榮  
地址 430072湖北省武漢市武昌珞珈山  
頒證日  
國(guó)際申請(qǐng)  
進(jìn)入國(guó)家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 武漢宇晨專利事務(wù)所  
代理人 王敏鋒  
國(guó)省代碼 湖北;42  
主權(quán)項(xiàng) 一種重組人tPA的制備方法,它包括下列步驟: A、利用工程菌株BL21/rtPAm-1,進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)重組tPA,工程菌株BL21(DE3)/rtPAm-1,CCTCCM205112,利用工程菌株BL21/rtPAm-1發(fā)酵生產(chǎn)重組人tPA包括步驟:首先是斜面種子培養(yǎng):用LB培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)18-20小時(shí);其次是瓶搖種子制備:用2YT培養(yǎng)基,搖瓶培養(yǎng),37℃培養(yǎng)12-14小時(shí);第三是發(fā)酵培養(yǎng):用發(fā)酵培養(yǎng)基,37℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá); B、tPA包涵體的提取和純化: 離心收集菌體,超聲波破碎菌體,離心去上清,沉淀用pH8.0的Tris-NaCl-吐溫-20和純凈水各洗滌三次; C、包涵體的溶解和變性: 按5-10克tPA濕重/升的量將tPA包涵體加到7-8M尿素中,用NaOH調(diào)節(jié)pH至9-10,加入還原劑β-巰基乙醇至10-20mM,28-32℃攪拌溶解0.5-1小時(shí),進(jìn)行溶解和變性; D、tPA復(fù)性,其方法如下: (a)加水將變性液稀釋一倍,使尿素濃度降至4M以下,tPA開(kāi)始復(fù)性; (b)用G50Sephadex分子篩柱層析逐漸去除復(fù)性液中的尿素和還原劑β-巰基乙醇,使tPA逐步復(fù)性,同時(shí)又去除分子量30kD以下的雜蛋白; (c)將收集的tPA溶液用pH8.0的10mM-20mMTris-Cl進(jìn)行稀釋,至tPA濃度為1-2克濕重/升,在20-25℃及pH8.0的條件下,放置16-24小時(shí),進(jìn)行進(jìn)一步復(fù)性; E、柱層析純化和濃縮: (a)用Q-Sepharose4FF柱分離復(fù)性正確和復(fù)性不正確的tPA蛋白,柱子先用0.5MHCl進(jìn)行預(yù)處理,再用水洗至pH5.0-6.0,然后用2倍體積的pH8.0-8.5的20mMTris-Cl進(jìn)行平衡,復(fù)性液經(jīng)過(guò)濾后,加入pH8.0的Tris-Cl至20mM,上柱,用pH7.5的10mMTris-Cl,0.1-0.5MNaCl進(jìn)行梯度洗脫,收集有活性的tPA洗脫峰,或用pH7.5的10mMTris-Cl,0.15-0.2MNaCl洗脫雜蛋白,再用pH7.5的10mMTris-Cl,0.25-0.35MNaCl洗脫有活性的tPA; (b)進(jìn)一步用疏水層析柱Phenyl-Sepharose6FF對(duì)tPA進(jìn)行純化,柱子用pH6.5-7.5的5mMTris-Cl,0.4-0.6MNaCl進(jìn)行平衡,在Q-Sepharose4FF柱洗脫的tPA液中加入NaCl至0.4-0.6M,用HCl調(diào)節(jié)pH至7.0-7.5,上柱,用pH8.0-9.0的2.5-5mMTris進(jìn)行洗脫,收集有活性的tPA; (c)用膜濾器對(duì)tPA洗脫液進(jìn)行濃縮,至tPA濃度3×105IU/ml; F、tPA冷凍干粉針劑制備: 采用冷凍干燥法將濃縮的tPA溶液制成冷凍干粉制劑。  
摘要 本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人tPA的制備方法,包括了從工程菌株發(fā)酵生產(chǎn),tPA包涵體的提取、復(fù)性、純化、濃縮,到tPA產(chǎn)品的冷凍干粉制備等的全套生產(chǎn)工藝,其中重點(diǎn)解決了tPA包涵體的復(fù)性、tPA純化等關(guān)鍵技術(shù)。利用本發(fā)明所提供的制備方法,從10L發(fā)酵體積中可生產(chǎn)tPA晶體濕重10克以上,變性、復(fù)性后總活性可高達(dá)3-4×108IU,總的復(fù)性效率>10%,復(fù)性后有活性tPA的回收率達(dá)到60%,純化后tPA的純度達(dá)99%以上。本發(fā)明提供的tPA制備方法具有產(chǎn)量高、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、效率高的優(yōu)點(diǎn),所提供的生產(chǎn)工藝可很快轉(zhuǎn)化為工業(yè)化生產(chǎn)工藝。  
國(guó)際公布  
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