| 公開(公告)號 | CN1840709A |
| 公開(公告)日 | 2006.10.04 |
| 申請(專利)號 | CN200610013093.7 |
| 申請日期 | 2006.01.23 |
| 專利名稱 | 篩選與鑒定治療免疫耐受相關疾病功能基因SERPINH1的方法 |
| 主分類號 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分類號 | C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/04(2006.01)I;C12N5/08(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 南開大學 |
| 發(fā)明(設計)人 | 楊榮存;劉 昱;R.盧登;W.如適;張 園;張灼寒 |
| 地址 | 300071天津市衛(wèi)津路94號南開大學醫(yī)學院 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | 天津市學苑有限責任專利代理事務所 |
| 代理人 | 趙尊生 |
| 國省代碼 | 天津;12 |
| 主權項 | 一種篩選與鑒定治療免疫耐受相關疾病功能基因SERPINH1的方法，其特征在于包括下述步驟： (1)免疫耐受樹突細胞的制備和鑒定 1)取小鼠的骨髓細胞，用水溶解去除紅細胞后，在1000單位GM-CSF，10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中，37℃溫度下培養(yǎng)4天的骨髓起源的樹突細胞作為未成熟的樹突細胞； 2)用生理鹽水洗三次未成熟的樹突細胞，分別與鼠卵巢癌腫瘤細胞，已照射Co60的鼠卵巢癌細胞或鼠卵巢癌細胞上清液在1000單位GM-CSF，10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)9天； 3)用2μlFITC螢光素標記的CD80抗體(BDPharMingen公司)染鼠卵巢腫瘤細胞與樹突細胞，在10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中混和培養(yǎng)9天，然后通過流式細胞儀分離出樹突細胞，得腫瘤相關免疫耐受樹突細胞； 4)觀察腫瘤相關免疫耐受樹突細胞的形態(tài)與結構； 5)將腫瘤相關免疫耐受樹突細胞用生理鹽水洗三次后，分別加2μlFITC螢光素標記的抗CD40、CD80和CD86抗體染色，流式細胞儀分析，分析免疫耐受樹突細胞刺激分子的表達； 6)用類乳頭瘤病毒質粒(VLP)免疫鼠引導的特異性T細胞作為靶細胞，腫瘤相關免疫耐受樹突細胞與對照樹突細胞在裝載類乳頭瘤病毒質粒(VLP)后作為刺激細胞；在10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)48小時，取上清液，通過酶聯(lián)免疫檢測試劑盒分析上清液中的IFN-γ(干擾素γ)含量； (2)免疫耐受樹突細胞內免疫耐受基因的篩選 1)用Trizol試劑從腫瘤相關性樹突細胞提取總RNA； 2)用基因芯片對腫瘤相關性樹突細胞總RNA進行分析： 1、用寡核苷酸和dT作為引物以及SuperScriptchoice(cDNA合成試劑盒SuperScriptTMChoiceSystemForcDNASynthesisKit)合成單股cDNA； 2、合成雙股cDNA，雙股cDNA通過苯酚-氯仿抽提后，利用BioArrayRNAhighyieldTranscriptlabeling試劑盒(InzoBioche)，通過體外轉錄產(chǎn)生Biomylatedanti-sensecRNA； 3、處理過的cRNA在45℃下與Affymetrix基因組基因芯片雜交，用AffymetrixFluidicsStaion400洗染基因芯片除去未雜交的cRNA，然后用streptavidin-PE結合BiotimylatedcRNA，再與羊抗-streptavidinAb孵育；用Hewlett-PackardG2500GeneArray檢測熒光強度，用MicroArraySuite5.0軟件對每個基因芯片進行圖像分析； 4、采用AgilentBioanalyzer和“Labonachip”(芯片實驗室技術)證實所有樣本有著類似的rRNA比率； 5、根據(jù)美國基因庫提供生物信息，對在腫瘤相關免疫耐受樹突細胞基因芯片分析中明顯上調的基因或明顯下調的基因； 6、通過半定量PCR和定量PCR方法進一步評價SERPINH1基因在腫瘤相關的樹突細胞的高水平表達；根據(jù)基因庫提供生物信息，找出在腫瘤相關免疫耐受樹突細胞中明顯上調的SERPINH1基因序列如下： atgcgctctctccttctgggcaccttatgcctcttggccgtggccctggcagccgaggtg aagaaacccctagaggcggcagcccctggtactgcggagaagctaagttccaaggcgacc acactggcagagcgcagcacaggcctggccttcagcctatatcaggcgatggccaaagac caggcggtggagaacatcctcctgtcacccttggtggtggcctcatccctgggtcttgtg tcactgggtggtaaagccaccacagcgtcgcaggcgaaggcagtgctgagcgctgagaag ctgcgcgatgaggaggtgcacacggggctgggtgagctgctccgctccctcagcaactcc actgcgcgcaacgtgacctggaaactgggcagccgcctgtacgggcccagctccgtgagc ttcgccgatgacttcgtgcgcagcagcaagcaacactacaactgcgaacactccaagatc aacttccgagacaagcgcagcgccctgcagtccatcaacgagtgggcctcgcagaccacg gacggcaagctgcctgaggtcaccaaggatgtggagcgcacggatggggcactgcttgtg aacgccatgttctttaagccacactgggatgagaggtttcaccacaggatggtggacaac cgtggcttcatggtgacccgctcctatactgtgggtgttacgatgatgcaccggacaggc ctgtacaactactatgacgacgagaaggagaagctgcagatggtggagatgcccctggct cacaagctctccagcctcatcatcctcatgccccaccatgtggagccgctcgagcgcttg gagaagctgctgaccaaggagcagctgaaggcctggatgggaaagatgcagaagaaggct gtcgccatctccctgcccaagggcgtggtggaggtgacccatgacctgcagaaacatctg gcaggactgggcctgaccgaagccatcgacaagaacaaggcagacctatcgcgcatgtct ggcaagaaggacctgtacctggccagtgtgttccacgccactgccttcgagtgggacacc gagggcaacccctttgaccaagacatctacgggcgcgaggagctgcgcagccccaagctg ttctatgccgaccaccccttcatcttcctggtgcgagataatcagagcggctccttgctc ttcattggccgcctggtccggcccaagggagacaagatgcgagatgagttgtag 設計SERPINH1基因引物：5‘a(chǎn)tgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’；用Invitrogen提供的RT-PCR試劑盒進行分析； 用SybrGreenI檢測模式通過定量PCR，用TAKARA公司提供的SYBRgreenI螢光染料測定SERPINH1的轉錄水平； (3)克隆SERPINH1基因 用Trizol試劑從腫瘤相關性樹突細胞提取總RNA；用SERPINH1引物：5‘a(chǎn)tgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’，通過Invitrogen公司提供的RT-PCR試劑盒，擴增SERPINH1基因，并且通過Invitrogen膠提取試劑盒提取擴增的SERPINH1基因片段；然后通過Invitro |
| 摘要 | 本發(fā)明提供了診斷和治療免疫耐受相關疾病功能基因SERPINH1的篩選與鑒定方法。通過體外培養(yǎng)建立了制備人免疫耐受樹突細胞，SERPINH1基因在免疫耐受樹突細胞中的表達明顯升高。當SERPINH1基因或靶向這些基因的siRNA轉染單核細胞系，將影響其轉錄因素的激活，細胞因子的產(chǎn)生和共刺激分子的表達；重要的是轉染免疫調節(jié)細胞樹突細胞后能夠發(fā)揮特有的免疫調節(jié)功能，引導免疫耐受。該基因在免疫相關性疾病如抗移植排斥反應、腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病的治療方面有著巨大的潛在應用價值。 |
| 國際公布 |
