| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1872997A |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2006.12.06 |
| 申請(qǐng)(專(zhuān)利)號(hào) | CN200510026344.0 |
| 申請(qǐng)日期 | 2005.06.01 |
| 專(zhuān)利名稱(chēng) | 人異體間質(zhì)干細(xì)胞（攜帶治療基因)的大規(guī)模培養(yǎng)新工藝 |
| 主分類(lèi)號(hào) | C12N5/08(2006.01)I |
| 分類(lèi)號(hào) | C12N5/08(2006.01)I;C12N15/85(2006.01)I;C12N15/86(2006.01)I;C12N15/861(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I;A61P37/00(2006.01)I;A61P9/00(2006.01)I;A61P5/00(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人 | 上海二醫(yī)新生基因科技有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 張?jiān)聘?裘建英;董西銀 |
| 地址 | 201611上海市松江區(qū)車(chē)墩鎮(zhèn)車(chē)亭公路128號(hào)B-1/10 |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專(zhuān)利代理機(jī)構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國(guó)省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 人異體間質(zhì)干細(xì)胞(攜帶治療基因的種子細(xì)胞)在GMP條件下大規(guī)模培養(yǎng)新工藝，其創(chuàng)新性包括以下幾個(gè)重要生產(chǎn)工藝的改進(jìn)和創(chuàng)新：發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)技術(shù)；無(wú)血清培養(yǎng)工藝；治療基因的轉(zhuǎn)染技術(shù)(質(zhì)粒DNA、RNA分子、病毒載體和非病毒載體)；攜帶治療基因的間質(zhì)干細(xì)胞的大量富集。具體生產(chǎn)工藝步驟如下： (1).人異體間質(zhì)干細(xì)胞(攜帶治療基因)種子的來(lái)源和建立 取自引產(chǎn)胎兒的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(選擇前應(yīng)對(duì)抽取者母體做安全性要求的檢測(cè)如：HIV，乙肝，丙肝，梅毒，衣支原體，遺傳病，以及詳細(xì)地采集病史，排除不健康的諸多因素，證明鍵康和安全的引產(chǎn)兒)或胎盤(pán)，臍血，成體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。攜帶治療基因的種子人異體間質(zhì)干細(xì)胞的建立，分兩步進(jìn)行：從原代細(xì)胞開(kāi)始轉(zhuǎn)染治療基因，取已轉(zhuǎn)染治療基因的細(xì)胞作種子細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)至5-8代左右細(xì)胞(細(xì)胞傳代培養(yǎng)中觀察到，第10代的細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，細(xì)胞繁殖最旺盛)，達(dá)到生產(chǎn)量后，收集細(xì)胞；從原代細(xì)胞開(kāi)始傳代培養(yǎng)(不轉(zhuǎn)染治療基因)，傳代培養(yǎng)至5-8代左右細(xì)胞分別存入種子工作庫(kù)，備作大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)的工作種子。 (2).人異體間質(zhì)干細(xì)胞的放大(生產(chǎn)化)培養(yǎng) 用50L的特殊專(zhuān)用發(fā)酵罐，將人異體間質(zhì)干細(xì)胞工作細(xì)胞庫(kù)中的種子細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，按25L的發(fā)酵培養(yǎng)用量，接種1.5×105/mL的接種量，接種人異體間質(zhì)干細(xì)胞入罐，接種前先預(yù)熱發(fā)酵罐至37℃，用CO2校正和平衡培養(yǎng)基pH值。按間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)生長(zhǎng)條件，采用無(wú)血清或血清的培養(yǎng)介質(zhì)，進(jìn)行間質(zhì)干細(xì)胞發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)方法進(jìn)行生產(chǎn)化擴(kuò)增培養(yǎng)，為保持間質(zhì)干細(xì)胞不分化，培養(yǎng)基中絕不能加入有促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞分化潛能的細(xì)胞因子和細(xì)胞生長(zhǎng)因子，只能加入使細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)增殖的細(xì)胞因子和細(xì)胞生長(zhǎng)因子。發(fā)酵罐培養(yǎng)過(guò)程中的各項(xiàng)間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)條件的參數(shù)，由發(fā)酵罐的計(jì)算機(jī)程控自控檢測(cè)。培養(yǎng)過(guò)程中程控所顯示的培養(yǎng)參數(shù)變化，應(yīng)立即予以補(bǔ)充(特別是細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)介質(zhì)的要求和代謝產(chǎn)物清除)必須及時(shí)給予滿足，使罐內(nèi)的細(xì)胞生產(chǎn)在最佳狀況。細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，攪拌的速度約100-300r/min，不得大于350r/min，葉輪的切片應(yīng)光滑，不能有鋒尖的棱角在攪拌時(shí)損傷細(xì)胞。攪拌的目的是保持細(xì)胞均勻呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，保持罐內(nèi)立面的細(xì)胞均能得到所需的代謝物(如：氧，氨基酸，糖原，核酸等)和排除代謝的廢物，使細(xì)胞保持三維空間最佳生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞增殖至罐內(nèi)有效培養(yǎng)面積的80％時(shí)，進(jìn)行下階段治療基因的轉(zhuǎn)染過(guò)程。 (3).人間質(zhì)干細(xì)胞與治療基因載體共轉(zhuǎn)染培養(yǎng) 人間質(zhì)干細(xì)胞作于載體的靶細(xì)胞在發(fā)酵罐中大量擴(kuò)增培養(yǎng)，至罐內(nèi)培養(yǎng)密度的80％左右，將目的基因(質(zhì)粒DNA、RNA分子、病毒載體和非病毒載體)加入發(fā)酵罐中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，如果是轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA或RNA分子，技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，(轉(zhuǎn)染時(shí)加氯化鈣其它物質(zhì)以增加細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞膜空隙增大，易于吸入質(zhì)粒DNA到細(xì)胞內(nèi))，但轉(zhuǎn)染率不高。用病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染的過(guò)程比較復(fù)雜，特別是本發(fā)明著重推薦的腺相關(guān)病毒載體(rAAV)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。值得一提的是間質(zhì)干細(xì)胞在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的基本條件，應(yīng)盡量提供與體內(nèi)生活條件相接近的培養(yǎng)環(huán)境，培養(yǎng)環(huán)境至少包括以下幾個(gè)因素：所有與細(xì)胞接觸的設(shè)備，器材，溶液等，其中包括種子庫(kù)細(xì)胞培養(yǎng)和放大培養(yǎng)及生產(chǎn)過(guò)程，都必須保持絕對(duì)無(wú)菌，避免細(xì)胞受微生物的污染；必須要有充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，絕對(duì)不能含有有害物質(zhì)，甚至極微量有害離子；保證有適量的氧氣供應(yīng)；及時(shí)清除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)；有良好的適于細(xì)胞生存的外界環(huán)境，包括滲透壓，離子密度，氨基酸濃度，氧分壓，二氧化碳分壓，葡萄糖濃度，pH值，氨濃度等，以及保持合適的細(xì)胞密度。 (4).人間質(zhì)干細(xì)胞(攜帶治療基因)的收集 間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)目的基因(質(zhì)粒DNA、RNA分子、病毒載體或非病毒載體)轉(zhuǎn)染后，利用反應(yīng)器(發(fā)酵罐)的濾膜排放系統(tǒng)將培養(yǎng)混合液濾放掉，排放去占發(fā)酵罐總體積約90％的培養(yǎng)液，留下大約5L的細(xì)胞混合液，在洗脫液的洗脫下，將細(xì)胞和洗脫液一起經(jīng)過(guò)離心或過(guò)濾，收集沉淀的細(xì)胞層；等測(cè)試細(xì)胞凍存制品的安全性和細(xì)胞生物活性后，分別罐裝入西林瓶中，貼上標(biāo)簽，再存入液氮中保存，分裝時(shí)的細(xì)胞(攜帶治療基因)加入適量的冰凍保護(hù)液以保證細(xì)胞在冰凍中不易破壞，保持細(xì)胞的生物活性。在銷(xiāo)售到臨床使用整個(gè)過(guò)程也應(yīng)做到液氮低溫運(yùn)送條件，使產(chǎn)品在臨床使用時(shí)，始終保持最佳的生物活性。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開(kāi)了一種人異體間質(zhì)干細(xì)胞被用于基因治療載體的商業(yè)化培養(yǎng)工藝，解決了人異體間質(zhì)干細(xì)胞(攜帶治療基因)從實(shí)驗(yàn)室制備到工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中的一系列難題，特別是采用發(fā)酵罐和轉(zhuǎn)瓶的生產(chǎn)工藝，使產(chǎn)量得到大幅提升，降低了生產(chǎn)成本，滿足了臨床商業(yè)化的要求；其次，是采用無(wú)血清生產(chǎn)工藝，克服和杜絕了動(dòng)物血清對(duì)產(chǎn)品的污染問(wèn)題。本發(fā)明的生產(chǎn)工藝過(guò)程包括：人異體間質(zhì)干細(xì)胞(攜帶治療基因的種子細(xì)胞)的生產(chǎn)培養(yǎng)；治療基因的轉(zhuǎn)染和導(dǎo)入(質(zhì)粒DNA、RNA分子、病毒載體如AV、AAV等以及非病毒載體)；細(xì)胞的收集和純化；安全性和生物活性檢測(cè)后包裝儲(chǔ)存。該生產(chǎn)工藝具有可控性和可操作性，保證了間質(zhì)干細(xì)胞的生物活性，有很高的生產(chǎn)效益。 |
| 國(guó)際公布 |
