| 公開(公告)號(hào) | CN1940074A |
| 公開(公告)日 | 2007.04.04 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200610069659.8 |
| 申請(qǐng)日期 | 2006.08.07 |
| 專利名稱 | 胃癌靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其用途 |
| 主分類號(hào) | C12N15/63(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N15/63(2006.01)I;C12N15/11(2006.01)I;C07H21/02(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 汪運(yùn)山 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 汪運(yùn)山;胡安拉;馬曉麗;朱之煒;肖東杰;孫善會(huì);郟雁飛;周 芳 |
| 地址 | 250013山東省濟(jì)南市歷下區(qū)解放路105號(hào)中心醫(yī)院 |
| 頒證日 | |
| 國際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 |
| 代理人 | 王緒銀 |
| 國省代碼 | 山東;37 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體，其特征是，以pSIREN-DNR-DsRed-Express DonorVector為載體，針對(duì)甲胎蛋白(AFP)基因編碼區(qū)上、中、下游的三段序列，在可特異表達(dá)AFP的人胃腺癌細(xì)胞株FU97中發(fā)揮RNA干擾作用，這三段AFP特異性RNA干涉靶序列分別為：①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’，起始于508位；②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’，起始于968位；③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，起始于1474位，是用于與AFP相關(guān)的胃癌的治療性物質(zhì)，由以下方法制得： (1)RNA干涉靶序列的選擇及插入序列的設(shè)計(jì)與合成 選擇AFP基因編碼區(qū)的三段序列①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’、②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’、③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，設(shè)計(jì)并分別體外合成兩段互補(bǔ)的寡核苷酸序列，序列如下： ①AFP寡核苷酸序列1： 正義鏈5’gatccGCAGGGAGACATTCATGAACTTCAAGAGAGTTCATGAATGTCTCCCTGTTTTTTACGCGTg3’ 反義鏈5’aattcACGCGTAAAAAACAGGGAGACATTCATGAACTCTCTTGAAGTTCATGAATGTCTCCCTGCg3’ ②AFP寡核苷酸序列2： 正義鏈5’gatccGCTGGAACGTGGTCAATGTATTCAAGAGATACATTGACCACGTTCCAGTTTTTTACGCGTg3’ 反義鏈5’aattcACGCGTAAAAAACTGGAACGTGGTCAATGTATCTCTTGAATACATTGACCACGTTCCAGCg3’ ③AFP寡核苷酸序列3： 正義鏈5’gatccGGCTGACATTATTATCGGATTCAAGAGATCCGATAATAATGTCAGCCTTTTTTACGCGTg3’ 反義鏈5’aattcACGCGTAAAAAAGGCTGACATTATTATCGGATCTCTTGAATCCGATAATAATGTCAGCCg3’ (2)將上述合成的寡核苷酸分別與線性載體pSIREN-DNR-DsRed-Express DonorVector連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取 首先用TE緩沖液重懸AFP寡核苷酸1/2/3干粉，上下游序列以1∶1混合，95℃30秒，72℃2分鐘，37℃2分鐘，25℃2分鐘完成退火；然后將退火后的雙鏈寡核苷酸與pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector用T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選，將單克隆陽性重組子小量擴(kuò)增，再用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA； (3)質(zhì)粒的鑒定 質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計(jì)分析測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和純度，并進(jìn)行插入片斷測(cè)序，以確定合成的寡核苷酸是否已正確轉(zhuǎn)入pSIREN-DNR-DsRed-Express DonorVector質(zhì)粒中。 |
| 摘要 | 一種胃癌靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體構(gòu)建、篩選及其用途。本發(fā)明以利用RNA干涉技術(shù)為主，針對(duì)AFP基因的不同靶序列，構(gòu)建了三個(gè)能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)shRNA的表達(dá)質(zhì)粒pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNAl、pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNA2和pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNA3，能高效的特異性的抑制AFP基因表達(dá)，可用于制備治療分泌AFP的胃癌的基因藥物。 |
| 國際公布 |
