蓖麻毒蛋白

    1.抗腫瘤作用
蓖麻毒蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞株和變異細(xì)胞株均十分敏感,0.02～0.3mg/ml可以抑制淋巴腺瘤SI、BW5147、MBC2、EL2、骨髓瘤P3、C1、RBS5、S117、S194、J588、MOPC315/P和骨髓樣白血病C1498的生長(zhǎng)。
蓖麻毒蛋白對(duì)小鼠艾氏腹水癌、腹水肝癌、宮頸癌U14、肉瘤S180及白血病等動(dòng)物移植性腫瘤均有一定治療作用。于接種后1,3d腹腔注射7.5mg/kg,能夠完全抑制艾氏腹水癌細(xì)胞生長(zhǎng),使小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)。1次腹腔注射蓖麻毒蛋白25mg/kg,48小時(shí)后可使癌細(xì)胞減少90%;96h后幾乎所有的癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生如下改變:細(xì)胞膨脹,核心出現(xiàn)空泡及有絲分裂停止,胞漿暗染,周圍亦出現(xiàn)不規(guī)則的空泡等。
蓖麻毒蛋白可以強(qiáng)烈抑制各種癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成,中等強(qiáng)度抑制DNA合成,而對(duì)RNA合成的抑制輕微。二氫蓖麻毒蛋白對(duì)家兔lysate的無細(xì)胞系統(tǒng)(cell-free system)蛋白質(zhì)合成有強(qiáng)烈的抑制作用,證明了它不是影響癌細(xì)胞的糖代謝或氨基酸的攝取,而是強(qiáng)烈地抑制真核生物核蛋白體的蛋白質(zhì)合成。
蓖麻毒蛋白具有二個(gè)肽鏈,由S-S鏈相聯(lián)。發(fā)生作用前有一個(gè)裂解過程,裂解后釋放出A鏈和B鏈,A鏈稱之為效應(yīng)鏈(effectomer):B鏈稱之為結(jié)合鏈(haptomer)。B 鏈可以與細(xì)胞表面的碳水化合物受體結(jié)合,反游離的A鏈或者整個(gè)毒蛋白分子通過質(zhì)膜帶入胞漿,與核蛋白體60-S亞基發(fā)生作用,抑制氨基酰t-RNA與核蛋白體的酰結(jié)合,使核酸的延伸因子減少,從而使核酸失活,抑制蛋白質(zhì)合成,并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
具有針對(duì)B細(xì)胞類Ia抗原特異反應(yīng)性Mab-737蓖麻毒蛋白通過二硫鍵連接成免疫毒素蓖麻毒蛋白-737 (ricin-737)。體外0.1M 乳糖存在時(shí),此免疫毒素對(duì)含B細(xì)胞抗原的Burkitt氏淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞表現(xiàn)出選擇性地強(qiáng)力殺傷,半數(shù)殺傷濃度IC50為5×10\-1M。同樣條件,以不含靶抗原的對(duì)照細(xì)胞K562沒有顯著殺傷,IC50 為5×10\-8M,毒性比前者低500倍。游離毒蛋白IC50 為5×10\-8M,比免疫毒素毒性低1000倍。動(dòng)力學(xué)研究表明,免疫毒素作用1h就可抑制靶細(xì)胞的增殖,并隨處理時(shí)間延長(zhǎng),殺傷更趨顯著。 結(jié)果提示,免疫毒素ricin-737具有強(qiáng)烈的選擇性殺傷細(xì)胞的能力,可成為腫瘤治療的候選藥物。
采用[3H]-亮氨酸摻入及噻唑藍(lán)活細(xì)胞兩種方法觀察了胃癌單克隆抗體一蓖麻毒蛋白A鏈對(duì)人胃癌細(xì)胞株KATO Ⅲ(靶細(xì)胞)及正常人胚肺細(xì)胞SL7(非靶細(xì)胞)經(jīng)24h反應(yīng)后的殺傷情況。結(jié)果表明交聯(lián)物對(duì)腫瘤靶細(xì)胞顯示選擇性殺傷作用,在1×10\-9M水平對(duì)靶細(xì)胞蛋白質(zhì)合成抑制率達(dá)71%,對(duì)非靶細(xì)胞無抑制作用。說明McAb對(duì)蓖麻毒蛋白A鏈具有較好的導(dǎo)向能力。
另據(jù)報(bào)道B鏈半乳糖結(jié)合位點(diǎn)封閉的蓖麻毒蛋白-胃癌單克隆抗體MGb2結(jié)合物的制備及其細(xì)胞毒特征。首先將引入碘乙酰基團(tuán)的毒素與引入硫基的抗體反應(yīng),得到的結(jié)合物通過瓊脂糖親和層析柱除去仍保留半乳糖結(jié)合能力的部分。細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明,結(jié)合物對(duì)腫瘤靶細(xì)胞具有較強(qiáng)的選擇性殺傷作用,在1.0×10\-1 1mol/L水平,對(duì)人胃癌細(xì)胞KATO Ⅲ 的殺傷率為46%,優(yōu)于MGb2-蓖麻毒蛋白A鏈結(jié)合物(12%),而對(duì)非靶細(xì)胞作用很弱,在1.0×10\-9mol/L水平對(duì)正常人胚肺細(xì)胞SL7殺傷率僅為42%,無需半乳糖拮抗。
免疫毒素(IT)是較為理想的一類腫瘤定向治療藥物。通過實(shí)驗(yàn)將多克隆抗甲胎蛋白抗體(aAFP)與蓖麻毒蛋白A鏈(RTA)偶聯(lián)成免疫毒素aAEp-RTA,并采用熒光染色、流式細(xì)胞儀技術(shù)測(cè)定該免疫毒素的體外細(xì)胞毒效應(yīng),初步證實(shí)了山羊抗大鼠aAFP-RTA免疫毒素對(duì)大鼠腹水型肝癌AH68細(xì)胞具有較強(qiáng)的特異性體外細(xì)胞毒效應(yīng),用熒光染色、流式細(xì)胞儀法測(cè)定抗腫瘤藥物的體外細(xì)胞毒作用具有快速、準(zhǔn)確及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
另據(jù)報(bào)道,從汀西野生蓖麻籽中提取了兩種植物毒蛋白ricin Ⅰ、ricin Ⅱ,其分子量分別為65,67KD。用制備的抗大腸癌單克隆抗體Hb3作為導(dǎo)向載體,與蓖麻毒蛋白A肽鏈交聯(lián),制備雜交分子Hb3-RTA。初步細(xì)胞毒試驗(yàn)顯示,交聯(lián)物Hb3-RTA對(duì)大腸癌細(xì)胞HRT-18具有較強(qiáng)殺傷作用,而對(duì)正常人淋巴細(xì)胞殺傷作用較小。
將蓖麻毒蛋白和阿霉素偶聯(lián)到一個(gè)抗人膀胱癌單克隆抗體分子上,構(gòu)建了第一個(gè)具有“雙彈頭”的抗腫瘤導(dǎo)向藥物。這個(gè)雙彈頭免疫毒素在0.1M半乳糖存在下,對(duì)無關(guān)癌細(xì)胞無殺傷作用,但對(duì)人膀胱癌細(xì)胞BIU-87及E-J細(xì)胞的殺傷作用比McAb-Ricin強(qiáng)10倍,比McAb-Adriamycin強(qiáng)約30 000倍。該藥中Ricin  B鏈具有細(xì)胞結(jié)合活性,因此不適于體內(nèi)應(yīng)用。但在體外,用0.1M的半乳糖封閉其B鏈的細(xì)胞結(jié)合點(diǎn)后,具有高度特異的強(qiáng)靶細(xì)胞殺傷活性。
2.熱原作用
蓖麻毒蛋白是一個(gè)很強(qiáng)的熱原物質(zhì)。它對(duì)各種哺乳類動(dòng)物和人類都具有十分強(qiáng)的致熱作用,0,05～0.2mg/kg就可以產(chǎn)生熱原反應(yīng),比其他任何熱原都強(qiáng)而持久,潛伏期也長(zhǎng)。大鼠皮下注射蓖麻毒蛋白20mg/kg,3.5h后體溫開始升高,持續(xù)時(shí)間超過6h。反復(fù)注射可以產(chǎn)生耐受性,但與細(xì)菌類熱原物質(zhì)無交叉耐受性。經(jīng)所造成的熱原反應(yīng)可用阿司匹林、非那西汀等解勢(shì)。故認(rèn)為它可作為解熱實(shí)驗(yàn)的工具藥。
3.免疫反應(yīng)
蓖麻毒蛋白具有很強(qiáng)的抗原性,以各種途徑進(jìn)入人體或各種哺乳動(dòng)物體內(nèi)可產(chǎn)生抗體和過敏反應(yīng),種植蓖麻的農(nóng)民血液中也存在這種抗體,稱之為蓖麻毒蛋白抗體,十分穩(wěn)定,除此之外,還可以使體內(nèi)非特異抗體升高。此過程中血漿組分發(fā)生變化,由于肝毒的作用,白蛋白水平下降,隨著肝再生白蛋白水平逐漸上升,α-球蛋白上升,而β-球蛋白下降。說明蓖麻毒蛋白特異地破壞蛋白質(zhì)的合成可以受抗體的作用而減弱;熱原反應(yīng)也可以被抑制。由于蓖麻毒蛋白能產(chǎn)生細(xì)胞毒作用,因此,它能抑制巨噬細(xì)胞等參與免疫功能的細(xì)胞。
識(shí)別普通型急性淋巴細(xì)胞白血病抗原(CAL-LA)的單克隆抗體共價(jià)連接到完整的蓖麻毒蛋白上,間接免疫熒光顯示此免疫毒素(79:Ricin)能與Nalm-1靶細(xì)胞結(jié)合。克隆化試驗(yàn)表明:半乳糖存在時(shí),10\-9～10\-8M 79:Ricin能殺死99.9%Nalm-1細(xì)胞。正常骨髓細(xì)胞的存在并不影響它清除靶細(xì)胞的效果。79:Ricin免疫毒素對(duì)骨髓造血干細(xì)胞毒性不大。
以BALB/C小鼠經(jīng)綿條紅細(xì)胞(SRBC)免疫后,初次反應(yīng)產(chǎn)生抗體所導(dǎo)致溶解SR-BC后的光密度值指標(biāo),測(cè)定了蓖麻毒蛋白對(duì)小鼠初次體液免疫應(yīng)答的影響。結(jié)果表明,蓖麻毒蛋白對(duì)小鼠的體液免疫功能有明顯的抑制作用,光密度值和凝血滴度分別下降到正常小鼠相應(yīng)數(shù)值的1/7和1/9左右。
4.對(duì)心血管和呼吸系統(tǒng)的作用
1次靜注蓖麻毒蛋白3.2mg/kg是使麻醉免產(chǎn)生心、肝、腎中毒反應(yīng)的臨界劑量,小于此量時(shí)對(duì)心血管及呼吸系統(tǒng)無明顯影響。而麻醉貓注射250～500mg/kg時(shí),血壓立即上升,脈搏、呼吸加快和潮氣量增加。當(dāng)注射劑量增至30mg/kg時(shí),血壓降至零,心跳停止于舒張期,出現(xiàn)潮式呼吸而死亡;心電圖出現(xiàn)R-R間隔延長(zhǎng),P波消失,T波倒置等現(xiàn)象。麻醉貓靜注蓖麻毒蛋白250～500mg/kg可以輕微地對(duì)抗β-受體興奮劑異丙腎上腺素。朱注射黎蘆堿25μg/kg,然后注射蓖麻毒蛋白可以使腎上腺素、去甲腎上腺素、乙酰膽堿、升壓素和組織胺的全部藥理學(xué)作用減弱。蓖麻毒蛋白還能降低黎蘆堿和尼古丁的Bezdd-Jarish反射作用。
5.其他作用
蓖麻毒蛋白可以影響體外培養(yǎng)的各類白細(xì)胞的呼吸作用。0.3～3.3mg/ml可降低單核細(xì)胞的耗氧量,增加淋細(xì)胞的耗氧量;16.6～33.2mg/ml可以降低淋巴細(xì)胞的耗氧量,增加嗜中性粒細(xì)胞的耗氧量;當(dāng)濃度增至66.6mg/ml時(shí),嗜中性粒細(xì)胞的呼吸亦受抑制。
6.體內(nèi)過程
蓖麻毒蛋白在體內(nèi)不易被各種酶水解,故維持較久,而一經(jīng)水解就很快排出。小鼠腹腔和靜脈注射125I一蓖麻毒蛋白后,5h內(nèi)在各組織和器官內(nèi)均保持較高的濃度,最高為脾,依次為腎、心、肝和胸腺,然后迅速下降,經(jīng)10～12h肝臟中消失,其他器官組織經(jīng)10～30h消失。主要由尿排出,排泄量在5～7h達(dá)高峰。