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2.3 腎小球GBM的超微結(jié)構(gòu)觀察
透射電鏡下可見，正常大鼠GBM結(jié)構(gòu)良好，足突排列整齊清晰，內(nèi)皮孔清晰可見。3周時(shí)可見GBM上足突增寬、部分或彌漫性融合甚至消失，足細(xì)胞有腫脹、細(xì)胞數(shù)明顯減少，表示造模成功。干預(yù)結(jié)束與B組比較，各治療組上述病變不同程度得到改善，足突結(jié)構(gòu)清晰、足突數(shù)目增多，其中C、E組改善明顯(圖1)。
2.4 腎小球GBM上AS的檢測結(jié)果
PEI示蹤的AS在透射電鏡下呈顆粒狀，沿著GBM和足突的形態(tài)分布。空白組大鼠GBM上PEI染色顆粒致密、大小規(guī)則，呈點(diǎn)線樣分布;顆粒分布以單層和雙層排列為多見，僅在少數(shù)GBM節(jié)段上可見3層排列，顆粒主要分布在外疏松層，內(nèi)疏松層可見少數(shù)PEI顆粒，但著色淺，排列和大小不規(guī)則。模型組大鼠GBM上PEI染色顆粒數(shù)量明顯減少，間距顯著增大并伴有顆粒丟失，部分GBM顯示不清晰，足突溶解融合。干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠GBM上PEI染色顆粒均有所上調(diào)，其中C、E組上調(diào)明顯，排列較規(guī)則;D組大鼠PEI著色較深，F(xiàn)組顆粒數(shù)量與B組無明顯差異(圖2)。對藥物干預(yù)后所有PEI染色的電鏡標(biāo)本AS進(jìn)行定量(個(gè)/1000nm GBM)分析，結(jié)果顯示，干預(yù)結(jié)束后與B組比較，C、D、E組大鼠GBM上PEI染色顆粒計(jì)數(shù)明顯增多(P<0.01)，F(xiàn)組顆粒數(shù)量則無明顯差異(表5)。表5 各組大鼠實(shí)驗(yàn)7周時(shí)的AS計(jì)數(shù)(略)與A組比較，#P<0.01;與B組比較，^^P<0.01。
3 討 論
腎小球?yàn)V過屏障由血管內(nèi)皮細(xì)胞、GBM及足細(xì)胞間的裂隙膜組成。GBM為一滿布負(fù)電荷的篩網(wǎng)，能限制大分子蛋白質(zhì)及帶負(fù)電荷的物質(zhì)通過，其重要的結(jié)構(gòu)功能蛋白——硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)帶負(fù)電荷而發(fā)揮其分子屏障和電荷屏障的功能。電荷屏障由腎小球的多陰離子及GBM上的AS兩部分組成。多陰離子主要是位于腎小球上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表面的涎糖蛋白,帶陰電荷成分主要是涎酸;GBM上的AS則由內(nèi)、外疏松層的HSPG組成。研究顯示，GBM上AS減少主要與HSPG的核心蛋白Perlecan和其HS側(cè)鏈減少以及Agrin蛋白的減少有關(guān)[2]。用PEI染色和陽離子膠體金技術(shù)對AN模型的研究發(fā)現(xiàn)，腎小球固定陰電荷明顯減少，可能與NO的調(diào)節(jié)有關(guān)[3]。在Heymann腎炎大鼠模型中，用PEI染色也發(fā)現(xiàn)AS位點(diǎn)明顯減少，與白蛋白的丟失明顯相關(guān)[4]。因此，研究GBM上AS的變化對于腎小球電荷屏障的結(jié)構(gòu)和功能有著重要的意義。
PEI是強(qiáng)陽離子大分子聚合物，其染色途徑多樣，能保持腎小球超微結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可與帶負(fù)電荷基團(tuán)在原位結(jié)合,且不僅能結(jié)合GBM上的AS，也可結(jié)合系膜區(qū)、小管基底膜和間質(zhì)中的AS[5]。其與重金屬絡(luò)合成密度較高的細(xì)顆粒, 在透射電鏡下可測定其大小、間距和分布，已廣泛用于電荷屏障的研究。用PEI示蹤發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠GBM明顯增厚，但GBM上AS顯著減少,胰島素治療或噻唑烷二酮干預(yù)可以阻止AS減少，即可有效修復(fù)GBM電荷屏障，降低尿白蛋白排泄率[6-7]。腎臟缺血再灌注后造成的腎臟損傷亦可通過此法觀察到GBM上AS顯著減少[8]。恰當(dāng)?shù)闹形麽t(yī)結(jié)合防治能有效地修復(fù)AN大鼠GBM電荷屏障[9-10]。醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站m.f1411.cn
中藥制劑在防治腎病蛋白尿方面有一定的優(yōu)勢。本研究結(jié)果顯示，祛風(fēng)組、激素組在修復(fù)GBM上AS方面療效顯著，而激素加祛風(fēng)組、苯那普利組則療效稍差，提示祛風(fēng)通絡(luò)方能夠有效防治蛋白尿，改善AN大鼠的相關(guān)生化指標(biāo)和GBM上AS的表達(dá)和分布異常，從而有效修復(fù)AN大鼠GBM電荷屏障。其機(jī)理可能為：該方良好的免疫調(diào)節(jié)作用抑制了AN大鼠的GBM及足細(xì)胞損傷;改善GBM相關(guān)蛋白HSPG和其HS側(cè)鏈的表達(dá)，從根本上修復(fù)GBM電荷屏障;其抗炎抗凝作用亦可改善AN大鼠的炎性介導(dǎo)損傷及GBM的血供。祛風(fēng)通絡(luò)方(烏梢蛇、海風(fēng)藤、防風(fēng)、黃芪、桑寄生、生地)是在長期臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)上加減而成。作者認(rèn)為腎病病因病機(jī)之一是風(fēng)邪伏于空虛之腎絡(luò)，久而腎絡(luò)瘀滯不通，發(fā)為腎病，此即“風(fēng)伏腎絡(luò)”病機(jī)。治療以祛腎絡(luò)之風(fēng)邪為主，兼補(bǔ)腎絡(luò)之虛損和通腎絡(luò)之瘀滯，創(chuàng)立祛風(fēng)通絡(luò)方劑。方中烏梢蛇祛風(fēng)通絡(luò)為君藥;海風(fēng)藤、防風(fēng)祛風(fēng)勝濕通絡(luò)為臣藥;佐以黃芪益氣祛風(fēng)通絡(luò)，桑寄生滋腎祛風(fēng)濕;使以生地養(yǎng)陰生津，既防諸藥之燥，又引諸藥入腎經(jīng)。全方體現(xiàn)祛風(fēng)通絡(luò)、益氣補(bǔ)腎之功。藥理研究認(rèn)為，烏梢蛇具有抗炎作用;海風(fēng)藤具有抗炎及免疫抑制及抗內(nèi)毒素作用;而黃芪具有改善全身血流動(dòng)力學(xué)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能等作用。該方所體現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)、抗凝、溶栓及抗增生作用亦符合腎病病理機(jī)制。前期研究也顯示，本方對大鼠腎小球系膜細(xì)胞的增殖及其TGF-β1和IL-6的mRNA表達(dá)有明顯的抑制作用，對增殖性腎炎有著良好的應(yīng)用前景[11]。臨床應(yīng)用本方，沒有皮質(zhì)激素的副作用，適合長期使用。
